«Нам нужна фенилаланингидроксилаза, чтобы контролировать уровень фенилаланина в крови, потому что слишком много фенилаланина токсично для мозга», – сказал Стив Мейсбургер, ведущий автор исследования и научный сотрудник лаборатории Андо. Генетические мутации в фенилаланингидроксилазе могут приводить к таким расстройствам, как фенилкетонурия, наследственное заболевание, которое может вызывать интеллектуальные и поведенческие нарушения, если не обнаружено при рождении и не лечится с помощью диетических ограничений.
В статье, опубликованной в журнале Американского химического общества, представлены подробные структурные данные об активном состоянии фермента – форме, которую он принимает при выполнении своих химических функций, – которые ускользали от ученых в течение многих лет.
«Это гибкий фермент, что означает, что он динамический», – сказал Нозоми Андо, доцент кафедры химии в Принстоне и автор статьи. "Это также означает, что он не любит кристаллизоваться", – сказала она. Это проблематично для классического метода исследования ферментативной структуры, известного как рентгеновская кристаллография, для которого требуются образцы твердых кристаллов. Попытки кристаллизовать фенилаланингидроксилазу недавно увенчались успехом, но все еще захватывает фермент только в неактивном состоянии.
Исследователи из лаборатории Андо смогли обойти сложную задачу выращивания кристаллов активного фермента, используя свой опыт в специальной технике, похожей на кристаллографию, называемой малоугловым рассеянием рентгеновских лучей (SAXS), которая позволяет ученым изучать ферменты в решение. А поскольку фермент подвержен агрегации или слипанию в растворе, исследователи объединили свой метод рассеяния с техникой очистки, называемой эксклюзионной хроматографией (SEC), при которой разные частицы в образце протекают через колонку с разной скоростью в зависимости от их размера.
"Соединение SEC с SAXS – новая техника. Наш вклад состоит в том, что мы нашли умный способ его использовать ", – сказал Андо.
Эксперимент является узкоспециализированным и основан на мощных рентгеновских лучах, испускаемых частицами, движущимися по круговой траектории на синхротронной установке. Исследовательская группа отправилась из Принстона в Корнеллский высокоэнергетический синхротронный источник в Итаке, штат Нью-Йорк, для нескольких интенсивных сессий по сбору данных. "Каждый раз, когда машина доступна, мы используем ее. Ни один фотон не тратится зря », – сказал Андо.
По мере того, как раствор фермента проходит через метод очистки, проходя по пути рентгеновского луча, исследователи делают снимки диаграмм рассеяния рентгеновских лучей.
Полученный набор данных довольно сложен, поскольку образец также содержит фенилаланин, соединение, которое «включает» фенилаланингидроксилазу, чтобы исследователи могли уловить динамический фермент в действии.
«Текущие подходы к анализу этого типа наборов данных очень грубые», – сказал Мейсбургер. По сути, эти методы предполагают, что каждый сигнал, известный как пик элюирования, представляет один вид, тогда как каждый пик на самом деле представляет собой смесь видов. В этой работе команда использовала продвинутый метод линейной алгебры, известный как анализ развивающихся факторов, который позволил им разделить компоненты рассеяния. «Мы можем использовать эти методы линейной алгебры, чтобы« не смешивать »пересекающиеся виды, – сказал Мейсбургер. – Это то, что я считаю действительно захватывающим."
Применяя свой уникальный подход, исследователи смогли предоставить доказательства модели активной структуры фенилаланингидроксилазы, которая основана на недавней работе их сотрудников из группы Пола Фицпатрика в Научном центре здоровья UT в Сан-Антонио. В этой модели две молекулы фенилаланина стыкуются с парой сайтов на ферменте, объединяя пару плеч и освобождая активные центры для проведения химии, когда появляются новые молекулы фенилаланина.
"Я очень горжусь тем, что это наша первая статья [опубликованная с тех пор, как Андо стал преподавателем в Принстоне]. Мы хотели, чтобы он был очень количественным и тяжелым по биохимии плюс тяжелым по физической химии.
Я действительно доволен тем, как все получилось, – сказал Андо.