В Optica, журнале высокоэффективных исследований Оптического общества, исследователи из Бостонского университета, США, показывают, что их новая система конфокальной микроскопии multi-z может отображать мозг живых мышей с частотой видеоизображения и с полем зрения больше миллиметр.
Визуализация больших групп клеток требует быстрого захвата клеточных или субклеточных деталей в большом 3D-объеме. Это сложно, потому что большинство подходов к визуализации предполагает компромисс между скоростью, полем обзора и разрешением.
«Мы нашли способ объединить необходимые функции визуализации в систему микроскопии, которую легко построить и использовать», – сказал Амори Бадон, первый автор статьи. "Он также предоставляет результаты в режиме реального времени без необходимости сложного анализа данных или обработки изображений."
Получение объемов 3D-изображений
Новый микроскоп основан на конфокальной микроскопии, методе, который обычно используется для визуализации клеток.
Конфокальная микроскопия позволяет получать изображения с высоким разрешением и контрастом за счет использования физического точечного отверстия, которое блокирует расфокусированный свет и пропускает сфокусированный свет. Однако сканирование образца для получения достаточного количества 2D-изображений для восстановления 3D-объема занимает много времени и дает большие объемы данных.
Чтобы получить одновременно несколько плоскостей, исследователи разработали способ многократного использования света для визуализации клеток в одной плоскости, чтобы также отображать клетки глубже в образце.
Они использовали подход, называемый расширенным освещением, при котором линза объектива микроскопа лишь частично заполняется освещающим светом, позволяя свету проникать глубже в образец. Затем используется полная линза объектива для обнаружения флуоресценции, что обеспечивает высокое разрешение. Вместо того, чтобы иметь одно точечное отверстие, как в традиционных конфокальных установках, новый микроскоп имеет серию отражающих точечных отверстий, каждое из которых захватывает сфокусированный свет с разной глубины внутри образца.
«Наш метод извлекает выгоду из контраста конфокальной микроскопии, при этом он может быть расширен до объемного изображения без ущерба для скорости», – сказал Бадон. «Несмотря на то, что расширенное освещение и отражающие точечные отверстия использовались и раньше, это первый раз, когда они были объединены в конфокальной микроскопической установке для эффективного использования света."
Исследователи также адаптировали микроскоп для получения изображений в более крупном масштабе, чем обычные конфокальные микроскопы, и сконструировали его для получения изображений с частотой видео. Быстрое получение изображений было важно, потому что индикаторы флуоресценции, которые контролируют клеточную функцию, обычно работают в масштабе времени в несколько десятков миллисекунд.
Визуализация нейронной активности у живых животных
Исследователи продемонстрировали систему конфокальной микроскопии multi-z, используя ее для изображения всего C. elegans, которые слишком велики (от 500 до 800 микрон), чтобы их можно было легко отобразить сразу с помощью традиционного конфокального микроскопа. Они одновременно выявляли и контролировали активность 42 нейронов во всем организме, даже когда черви двигались.
Затем они использовали свой микроскоп, чтобы получить изображение области гиппокампа мозга мыши бодрствующего животного, голова которого оставалась неподвижной. Они смогли отобразить активность нейронов в объеме размером 1200 X 1200 X 100 микрон со скоростью видео.
Используя алгоритм, исследователи смогли идентифицировать 926 нейронов в изображенном объеме.
Сейчас они работают над улучшением скорости и глубины проникновения техники, а также над тем, чтобы сделать микроскоп как можно более универсальным и удобным для пользователя.