Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли создали такую камеру: микроскоп, который может отображать мозг бдительной мыши 1000 раз в секунду, впервые регистрируя прохождение миллисекундных электрических импульсов через нейроны.
«Это действительно захватывающе, потому что теперь мы можем делать то, что люди действительно не могли делать раньше», – сказал ведущий исследователь На Джи, доцент кафедры физики, молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли.
Новый метод визуализации сочетает в себе двухфотонную флуоресцентную микроскопию и полностью оптическое лазерное сканирование в ультрасовременном микроскопе, который может отображать двумерный срез неокортекса мозга мыши со скоростью до 3000 раз в секунду. Этого достаточно, чтобы отслеживать электрические сигналы, проходящие через цепи мозга.
С помощью этой техники нейробиологи, такие как Джи, теперь могут синхронизировать электрические сигналы, когда они распространяются через мозг, и в конечном итоге искать проблемы передачи, связанные с болезнью.
Одним из ключевых преимуществ этого метода является то, что он позволит нейробиологам отслеживать от сотен до десятков тысяч входных сигналов, которые каждая данная клетка мозга получает от других клеток мозга, включая те, которые не запускают клетку срабатывания.
Эти подпороговые входы – либо возбуждающие, либо тормозящие нейрон – постепенно складываются в крещендо, которое заставляет клетку запускать потенциал действия, передавая информацию другим нейронам.
От электродов до флуоресцентной визуализации
Типичный метод регистрации электрического разряда в головном мозге с помощью электродов, встроенных в ткань, обнаруживает только вспышки от нескольких нейронов по мере прохождения миллисекундных изменений напряжения. Новый метод может точно определить фактический возбуждающий нейрон и проследить путь сигнала, миллисекунда за миллисекунду.
«При болезнях многое происходит еще до того, как вы можете увидеть срабатывание нейронов, как и все подпороговые события», – сказала Джи, член Института нейробиологии Хелен Уиллс Калифорнийского университета в Беркли. "Мы никогда не смотрели, как болезнь изменится при подпороговом вводе. Теперь у нас есть способ решить эту проблему."
Джи и ее коллеги сообщили о новой технике визуализации в мартовском номере журнала Nature Methods. В том же выпуске она и другие коллеги также опубликовали статью, демонстрирующую другой метод визуализации передачи сигналов кальция сразу по большей части всего полушария мозга мыши, в котором используется «мезоскоп» с широким полем обзора с двумя -фотонная визуализация и сканирование в фокусе Бесселя. Концентрация кальция связана с изменениями напряжения, поскольку сигналы передаются через мозг.
«Это первый раз, когда кто-либо показал в трех измерениях нейронную активность такого большого объема мозга одновременно, что намного превышает возможности электродов», – сказал Джи. "Кроме того, наш подход к визуализации дает нам возможность распознавать синапсы каждого нейрона."
Синапсы – это места, где нейромедиаторы высвобождаются одним нейроном для возбуждения или подавления другого.
Одна из целей Джи – понять, как нейроны взаимодействуют с большими участками мозга и в конечном итоге определить местонахождение пораженных цепей, связанных с нарушениями мозга.
«При расстройствах мозга, включая нейродегенеративные заболевания, заболевают не только один нейрон или несколько нейронов», – сказал Джи. "Итак, если вы действительно хотите разобраться в этих заболеваниях, вы хотите иметь возможность изучить как можно больше нейронов в разных областях мозга. С помощью этого метода мы можем получить гораздо более глобальную картину того, что происходит в мозгу."
Двухфотонная микроскопия
Джи и ее коллеги могут заглядывать в мозг благодаря зондам, которые могут быть прикреплены к определенным типам клеток и становятся флуоресцентными при изменении окружающей среды. Например, для отслеживания изменений напряжения в нейронах ее команда использовала датчик, разработанный соавтором Майклом Лином из Стэнфордского университета, который становится флуоресцентным, когда клеточная мембрана деполяризуется, когда сигнал напряжения распространяется вдоль клеточной мембраны.
Затем исследователи освещают эти флуоресцентные зонды двухфотонным лазером, который заставляет их излучать свет или флуоресцировать, если они были активированы. Излучаемый свет улавливается микроскопом и объединяется в двухмерное изображение, которое показывает место изменения напряжения или присутствие определенного химического вещества, такого как сигнальный ион кальция.
Быстро сканируя мозг лазером, подобно фонарику, который постепенно открывает сцену в затемненной комнате, исследователи могут получить изображения одного тонкого слоя неокортекса. Команда смогла проводить от 1000 до 3000 полных 2D-сканирований одного слоя мозга каждую секунду, заменив одно из двух вращающихся зеркал лазера оптическим зеркалом – метод, называемый задержкой с усилением углового чирпа в свободном пространстве (FACED). FACED был разработан соавтором статьи Кевином Циа из Университета Гонконга.
Килогерцовая визуализация не только показала миллисекундные изменения напряжения, но и более медленно изменяющиеся концентрации кальция и глутамата, нейромедиатора, на глубине 350 микрон (одна треть миллиметра) от поверхности мозга.
Чтобы получить быстрые трехмерные изображения движения кальция через нейроны, она объединила двухфотонную флуоресцентную микроскопию с другим методом – сканированием фокуса Бесселя. Чтобы избежать трудоемкого сканирования каждого микронного слоя неокортекса, фокус возбуждения двухфотонного лазера имеет форму от точки до небольшого цилиндра, как карандаш, длиной около 100 микрон.
Этот карандашный луч затем сканируется на шести различных глубинах через мозг, и флуоресцентные изображения объединяются для создания трехмерного изображения. Это позволяет более быстрое сканирование с небольшой потерей информации, потому что в каждом объеме, похожем на карандаш, обычно в любой момент времени активен только один нейрон.
Мезоскоп может отображать область диаметром около 5 мм – почти четверть полушария мозга мыши – и глубиной 650 микрон, почти на всю глубину неокортекса, который участвует в сложной обработке информации.