За последние несколько месяцев ученые многое узнали о механике этого безмозглого врага. Но то, что мы узнали, все еще бледнеет по сравнению с тем, чего мы не знаем.
Есть несколько способов, которыми ученые раскрывают действие вируса. «Только используя эти методы в тандеме, мы можем найти и использовать слабые места коронавируса», – говорит Ахмет Йилдиз, доцент кафедры физики и молекулярной клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли.
Йылдыз и его сотрудник Мерт Гур из Стамбульского технического университета объединяют моделирование молекулярной динамики на суперкомпьютере с экспериментами с одной молекулой, чтобы раскрыть секреты вируса.
В частности, они изучают его спайковый (S) белок, часть вируса, которая связывается с клетками человека и запускает процесс встраивания вирусной РНК в клетку.
«Многие группы атакуют разные стадии этого процесса», – сказал Гур. «Наша первоначальная цель – использовать моделирование молекулярной динамики для определения процессов, которые происходят, когда вирус связывается с клеткой-хозяином."
По словам Йилдиз, существует три критических фазы, которые позволяют белку-шипу проникнуть в клетку и начать репликацию.
Во-первых, белку-спайку необходимо преобразовать из закрытой конфигурации в открытую. Во-вторых, белок-спайк связывается со своим рецептором за пределами наших клеток. Это связывание вызывает конформационные изменения в белке шипа и позволяет другому белку человека расщепить шип.
Наконец, вновь открытая поверхность шипа взаимодействует с мембраной клетки-хозяина и позволяет вирусной РНК проникать в клетку и захватывать ее.
В начале февраля изображения под электронным микроскопом показали структуру белка спайков. Но на снимках показаны только основные конфигурации, которые принимает белок, а не переходные промежуточные этапы. «Мы видим только снимки стабильных конформаций», – сказал Йылдыз. "Поскольку мы не знаем времени событий, которые позволяют белку перейти от одной стабильной конформации к другой, мы еще не знаем этих промежуточных конформаций."
Вот где приходит компьютерное моделирование. Изображения под микроскопом служат полезной отправной точкой для создания моделей каждого атома в белке и его окружения (воды, ионов и рецепторов клетки).
Оттуда Йылдыз и Гур привели в движение белок и наблюдали, что происходит.
«Мы показали, что белок S посещает промежуточное состояние, прежде чем он сможет состыковаться с белком рецептора на мембране клетки-хозяина», – сказал Гур. "Это промежуточное состояние может быть полезно для нацеливания лекарств, чтобы предотвратить начало вирусной инфекции S-белком."
В то время как многие другие группы по всему миру исследуют связывающий карман вируса, надеясь найти лекарство, которое может заблокировать захват вируса на человеческие клетки, Йылдыз и Гур используют более тонкий подход.
«Спайковый белок прочно связывается со своим рецептором со сложной сетью взаимодействия», – пояснил Йилдиз. "Мы показали, что если вы просто прервете одно из этих взаимодействий, вы все равно не сможете остановить привязку.
Вот почему некоторые из основных исследований по разработке лекарств могут не дать желаемых результатов."
Но если можно предотвратить переход белка спайка из закрытого состояния в открытое – или третьего, промежуточного состояния, о котором мы даже не знаем, в открытое состояние – это может подойти для лечения.
Найдите и разрушьте важные связи
Второе использование компьютерного моделирования Йылдызом и Гуром выявило не только новые состояния, но и определенные аминокислоты, которые стабилизируют каждое состояние.
«Если мы сможем определить важные связи на уровне одной аминокислоты – которые стабилизируют взаимодействия и имеют решающее значение для этих подтверждений – можно будет воздействовать на эти состояния с помощью небольших молекул», – сказал Йилдиз.
Моделирование этого поведения на уровне атома или отдельной аминокислоты требует невероятных вычислительных ресурсов. Йылдиз и Гур получили время на суперкомпьютере Stampede2 в Техасском центре передовых вычислений (TACC) – втором по скорости суперкомпьютере в Университете штата Вашингтон.S. университет и 19-е место по быстродействию – благодаря Консорциуму COVID-19 HPC. Моделирование одной микросекунды вируса и его взаимодействия с клетками человека – всего около миллиона атомов – занимает на суперкомпьютере несколько недель…и потребовались бы годы без одного.
«Это требовательный к вычислениям процесс», – сказал Йылдыз. "Но предсказательная сила этого подхода очень сильна."
Команда Йылдыза и Гура, а также около 40 других исследовательских групп, изучающих COVID-19, получили приоритетный доступ к системам TACC. "Мы не ограничены скоростью, с которой происходит моделирование, поэтому в реальном времени идет гонка между нашей способностью запускать моделирование и анализировать данные."
Со временем Гур и его сотрудники произвели расчеты, воспроизводя атомные переходы белка-шипа, когда он приближается, связывается и взаимодействует с рецепторами ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2) – белками, которые выстилают поверхность многих типов клеток.
Их первоначальные результаты, которые предполагали существование промежуточного полуоткрытого состояния белка S, совместимого со связыванием RBD-ACE2 с помощью моделирования всеатомной молекулярной динамики (МД), были опубликованы в Journal of Chemical Physics.
Кроме того, выполняя моделирование МД для всех атомов, они идентифицировали расширенную сеть солевых мостиков, гидрофобных и электростатических взаимодействий и водородных связей между рецептор-связывающим доменом белка-шипа и ACE2. Результаты этих открытий были опубликованы в BioRxiv.
Мутации остатков в рецептор-связывающем домене было недостаточно для дестабилизации связывания, но уменьшало среднюю работу по отвязке белка-шипа от ACE2. Они предполагают, что блокирование этого сайта с помощью нейтрализующего антитела или нанотела может оказаться эффективной стратегией ингибирования взаимодействий спайковый белок-ACE2.
Чтобы подтвердить точность компьютерных выводов, команда Йилдиза провела лабораторные эксперименты с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции одиночных молекул (или smFRET) – биофизического метода, используемого для измерения расстояний в единичных молекулах в масштабе от одного до 10 нанометров
«Этот метод позволяет нам увидеть конформационные изменения белка путем измерения передачи энергии между двумя светоизлучающими зондами», – сказал Йилдиз.
Хотя у ученых до сих пор нет техники, чтобы увидеть атомные детали движущихся молекул в реальном времени, сочетание электронной микроскопии, визуализации отдельных молекул и компьютерного моделирования может предоставить исследователям богатую картину поведения вируса, Йылдиз говорит.
"Мы можем получить снимки замороженных молекул в атомарном разрешении с помощью электронной микроскопии. Мы можем получить моделирование движущегося белка на атомарном уровне, используя молекулярную динамику, за короткий промежуток времени. А с помощью одномолекулярных методов мы можем получить динамику, отсутствующую в электронной микроскопии и моделировании », – заключил Йилдиз. "Объединение этих методов вместе дает нам полную картину и анализирует механизм проникновения вируса в клетку-хозяин."