Теперь исследователи из Японии показали, что стеклянная поверхность, покрытая самоорганизующимися наночастицами золота, может улучшить разрешение с небольшими дополнительными затратами даже при использовании обычного широкопольного микроскопа, облегчая флуоресцентную микроскопию с высоким разрешением, позволяющую получать изображения живых клеток с высокой скоростью.
Поскольку оптические микроскопы увеличивают свет, чтобы получить подробные изображения структуры, размер объектов, которые можно различить, долгое время ограничивался дифракцией – свойством света, которое заставляет его распространяться при прохождении через отверстие.
Исследователи разрабатывают методы преодоления этих ограничений с помощью высокоразвитых оптических систем, но многие из них зависят от использования сильных лазеров, которые могут повредить или даже убить живые клетки, а также сканирования образца или обработки нескольких изображений, что препятствует реальному использованию. -временная визуализация.
«Современные методы позволяют создавать потрясающие изображения, но многие из них требуют узкоспециализированного оборудования и не позволяют наблюдать движение живых клеток», – говорит Каору Тамада, выдающийся профессор Института химии материалов и инженерии Университета Кюсю.
Визуализируя клетки с помощью методов флуоресцентной микроскопии в реальном времени, Тамада и ее группа обнаружили, что они могут улучшить разрешение под обычным широкопольным микроскопом почти до дифракционного предела, просто изменив поверхность под клетками.
В флуоресцентной микроскопии интересующие клеточные структуры помечаются молекулами, которые поглощают энергию падающего света и в процессе флуоресценции повторно излучают ее как свет другого цвета, который собирается для формирования изображения.
Хотя клетки обычно изображаются на простом стекле, группа Тамады покрыла поверхность стекла самособирающимся слоем наночастиц золота, покрытых тонким слоем диоксида кремния, создав так называемую метаповерхность с особыми оптическими свойствами.
Организованные металлические наночастицы диаметром всего 12 нм демонстрируют явление, известное как локализованный поверхностный плазмонный резонанс, который позволяет метаповерхности собирать энергию от близлежащих светоизлучающих молекул для высокоэффективного переизлучения, тем самым производя усиленное излучение, ограниченное 10-нм. толстая поверхность наночастиц.
«Введя наночастицы, мы эффективно создали светоизлучающую плоскость толщиной всего несколько нанометров», – объясняет Тамада. "Поскольку интересующий свет излучается из такого тонкого слоя, мы можем лучше сосредоточиться на нем."
Дополнительные преимущества возникают из-за быстрой передачи энергии на метаповерхность, дальнейшей локализации точек излучения за счет уменьшения диффузии и высокого показателя преломления метаповерхности, что помогает улучшить разрешение в соответствии с дифракционным пределом Аббе.
Используя метаповерхность, исследователи в реальном времени визуализировали мышиные клетки, известные как фибробласты 3T3, которые были генетически сконструированы для производства белка под названием паксиллин, который при возбуждении модифицируется, чтобы излучать зеленый свет. Паксиллин играет ключевую роль в создании очаговых спаек – точек, в которых молекулы клеточной мембраны взаимодействуют с внешним миром.
Освещая весь образец лазерным светом, перпендикулярным поверхности, исследователи смогли отобразить изменения паксиллина возле клеточной мембраны с более высоким разрешением, используя метаповерхность вместо стекла.
Наклоняя освещающий свет для достижения полного внутреннего отражения, исследователи могли получать изображения с еще более высокой контрастностью, поскольку большая часть освещающего света отражается от поверхности, и лишь небольшая часть достигает стороны ячейки, тем самым уменьшая паразитное излучение, создаваемое освещением, проникающим глубоко внутрь. сотовый.
Анализ изображений, записываемых каждые 500 миллисекунд цифровой камерой сверхвысокого разрешения, выявил четкие различия в интенсивности по пятнам, охватывающим всего несколько пикселей, что указывает на то, что разрешение составляло около 200 нм – близко к дифракционному пределу.
Клетки также можно было дольше отображать на метаповерхности, потому что излучение было усилено, несмотря на меньшую входную энергию, тем самым уменьшая повреждение клеток с течением времени.
«Метаповерхности – многообещающий вариант улучшения разрешения для исследователей во всем мире, использующих обычные оптические микроскопы, которые у них уже есть», – комментирует Тамада.
В дополнение к продолжающемуся совершенствованию поверхностей для использования с обычными микроскопами, исследователи также изучают преимущества, которые они могут иметь для более сложных систем микроскопов.