Замена определенных химических строительных блоков в флуоресцентных молекулах, называемых родаминами, может вызвать практически любой цвет, который пожелают ученые – ROYGBIV и не только, сообщают исследователи 4 сентября 2017 года в журнале Nature Methods.
Работа предлагает ученым способ сознательно регулировать свойства существующих красителей, делая их более яркими, яркими и проницаемыми для клеток. Такая расширенная палитра красителей может помочь исследователям лучше осветить внутреннюю работу клеток, говорит руководитель исследования Люк Лавис, руководитель группы исследовательского кампуса Janelia Медицинского института Говарда Хьюза в Эшберне, штат Вирджиния.
Его команда освещала ядра клеток, заставляла сиять мозги личинок плодовой мушки и выделяла нейроны зрительной коры у мышей, у которых были крошечные стеклянные окна, встроенные в их черепа.
По словам Лависа, ученые придумывали разные красители в основном методом проб и ошибок. "Теперь мы выяснили правила и можем сделать почти любой цвет."Метод его команды может позволить химикам синтезировать сотни различных цветов.
Яркая история
Примерно 20 лет назад ученые полагались на химические флуоресцентные красители, чтобы сделать биологические молекулы видимыми. Для заглядывания внутрь клеток, окрашивания органелл и других экспериментов по визуализации «химия была королем», – написал Лавис в статье 13 июля 2017 года в журнале Biochemistry. А потом король был сброшен с трона – светящимся зеленым белком медузы под названием GFP.
В 1994 году ученые сообщили об использовании генетического трюка, чтобы прикрепить GFP, зеленый флуоресцентный белок, к другим клеточным белкам; это как заставить белки держать светящуюся палочку.
Этот трюк дал исследователям более простой способ отслеживать движение белков под микроскопом – без использования дорогостоящих синтетических красителей. Инновация появилась в области биологической визуализации. В 2007 году ученые смешали GFP и два других флуоресцентных белка, что позволило им раскрасить нейроны мыши парадом ярких цветов с помощью техники, известной как "Brainbow"."Год спустя открытие и разработка GFP принесли Нобелевскую премию по химии трем ученым, включая покойного Роджера Цзяня, исследователя HHMI.
Но у GFP есть и темные стороны.
Это относительно неуклюжая молекула, построенная из ограниченного набора природных аминокислот. Таким образом, GFP не всегда достаточно яркий, чтобы показать то, что ученые пытаются увидеть.
Итак, исследователи вернулись к химии. По словам Лависа, ученые разработали ультрасовременные микроскопы и новые методы маркировки клеточного содержимого, но красители для маркировки молекул внутри клеток все еще застряли в девятнадцатом веке.
Его команда сосредоточилась на родаминах, потому что они особенно яркие и проницаемые для клеток – поэтому они легко проникают в клетки и заставляют их светиться. Но, несмотря на то, что они работали с родаминами более 100 лет, химики создали всего несколько десятков цветов, и большинство из них были похожими оттенками от зеленого до оранжевого.
До недавнего времени создание новых родаминов было непростым делом. Ученые все еще использовали методы из первых дней химии, кипячение химических ингредиентов в серной кислоте. Это заставляет молекулы соединяться вместе в так называемой реакции конденсации. Смешивая разные строительные блоки, можно получить новые необычные красители.
Но ингредиенты должны были быть достаточно жесткими, чтобы выдержать ванну с кипящей кислотой, что оставляло не так много вариантов.
Сделай это светиться
В 2011 году команда Лависа разработала новый способ работы со структурой родаминов в более мягких условиях. Используя реакцию, инициированную металлическим палладием, исследователи могли пропустить кислотную стадию и создать красители с более сложными строительными блоками, чем те, которые использовались ранее.
Этот более добрый и нежный подход открыл дверь в совершенно новый мир красок, и команда Лависа погрузилась в него.
Четыре года спустя они открыли красители Janelia Fluor, флуоресцентные молекулы, которые в 50 раз ярче, чем другие красители, и к тому же более стабильны. Секрет красок Janelia Fluor – это крошечный квадратный отросток, называемый азетидиновым кольцом – структура, которая стала возможной только благодаря новому химическому подходу Лависа.
Ученые могут использовать различные стратегии, чтобы нанести молекулы яркого красителя на белок, который они хотят изучить. Затем они могут сосредоточиться на подсвеченном белке и наблюдать, как он извивается и взаимодействует с другими молекулами – без обычной размытости фона.
«Для нас это была полная революция в области визуализации одиночных молекул», – говорит молекулярный биолог Ксавьер Дарзак из Калифорнийского университета в Беркли. Перед использованием красителей Janelia Fluor белки факторов транскрипции с флуоресцентными метками, изученные его командой, были слишком тусклыми, чтобы их можно было запечатлеть на четких изображениях. Исследователям пришлось держать затвор камеры открытым в течение 10 миллисекунд, чтобы собрать достаточно света. Этого времени достаточно, чтобы белки блуждали, поэтому изображение получилось размытым – как фотография извивающегося малыша.
Но красители Janelia достаточно яркие, чтобы его команда могла улавливать молекулы в действии всего за миллисекунду, говорит Дарзак. Такие быстрые снимки позволили его команде проводить лабораторные эксперименты, которые он описал как «просто немыслимые несколько лет назад."
Теперь группа Лависа выяснила, как точно настроить свои флуоресцентные красители, еще больше настроив структуру родаминов.
Родамины имеют базовую четырехкольцевую структуру с группами атомов, выступающими из разных частей колец. В предыдущей работе ученые разработали стратегии для грубой настройки красителей – вырежьте здесь весь придаток, и вы можете сделать зеленый краситель. Вставьте туда атом кремния, и у вас будет красный. Лавис обнаружил, что, аккуратно поместив всего несколько новых атомов в структуру красителя, можно точно настроить цвет и химические свойства красителей, что позволяет использовать множество оттенков зеленого на одном каркасе.
Это как перейти от классической упаковки из восьми мелков к огромной коробке из 64 штук.
В отдельной статье, опубликованной 9 августа 2017 года в журнале ACS Central Science, команда описала способ изменения нижнего кольца структуры красителя.
«Главное, что все это модульное и рациональное», – говорит Лавис. Он объясняет, что если выбрать правильные атомы, химики могут создавать красители практически с любыми свойствами.
Его группа привила родаминам различные химические вещества, а затем проанализировала свойства новых красителей. «Никто никогда раньше не рассматривал родамины таким систематическим образом», – говорит ведущий соавтор Джонатан Гримм, старший научный сотрудник Janelia.
По словам Лависа, красители синтезируются за один этап из недорогих ингредиентов.
Это делает красители дешевле, чем коммерческие альтернативы – гроши за флакон. Низкая стоимость позволила его команде поделиться своей работой с учеными всего мира.
Лавис, Гримм и его коллеги отправили тысячи флаконов в сотни различных лабораторий.
«Эти красители полностью меняют правила игры», – говорит Итан Гарнер, биолог бактериальных клеток из Гарвардского университета, который использовал их для отслеживания пути одиночных молекул в своей лаборатории.
Единственным недостатком было то, что у ученых было не так много разных цветов на выбор. Но теперь, по его словам, благодаря работе Лависа «они действительно могут покрывать весь спектральный диапазон."