Ключ к новой технике – расширение ткани перед ее визуализацией. Увеличив физически образец, можно получить изображение с очень высоким разрешением с помощью обычных микроскопов, которые обычно используются в исследовательских лабораториях.
«Теперь мы можем отображать РНК с большой пространственной точностью благодаря процессу расширения, и мы также можем делать это более легко в больших неповрежденных тканях», – говорит Эд Бойден, доцент кафедры биологической инженерии, мозга и когнитивных наук в Массачусетском технологическом институте. член Media Lab Массачусетского технологического института и Института исследований мозга Макговерна, а также старший автор статьи, описывающей эту технику, в выпуске журнала Nature Methods от 4 июля 2016 г.
Изучение распределения РНК внутри клеток могло бы помочь ученым узнать больше о том, как клетки контролируют экспрессию своих генов, а также могло бы позволить им исследовать заболевания, которые, как считается, вызваны неспособностью РНК переместиться в правильное место.
Бойден и его коллеги впервые описали базовый метод, известный как экспансионная микроскопия (ExM), в прошлом году, когда они использовали его для изображения белков внутри больших образцов ткани мозга. В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology 4 июля, команда Массачусетского технологического института представила новую версию технологии, в которой используются стандартные химические вещества, что упрощает использование исследователями.
Аспиранты Массачусетского технологического института Фэй Чен и Асмамав Васи являются ведущими авторами статьи о методах природы, а Чен и аспирант Пол Тилберг – ведущими авторами статьи о биотехнологии природы.
Более простой процесс
Оригинальный метод экспансионной микроскопии основан на погружении образцов ткани в полимер, который набухает при добавлении воды. Такое увеличение ткани позволяет исследователям получать изображения с разрешением около 70 нанометров, что ранее было возможно только с помощью очень специализированных и дорогих микроскопов.
Однако этот метод создал некоторые проблемы, поскольку он требует создания сложной химической метки, состоящей из антитела, нацеленного на конкретный белок, связанного как с флуоресцентным красителем, так и с химическим якорем, который прикрепляет весь комплекс к полимеру с высокой абсорбцией, известному как полиакрилат. После того, как мишени помечены, исследователи разрушают белки, которые удерживают образец ткани вместе, позволяя ему равномерно расширяться по мере набухания полиакрилатного геля.
В своих новых исследованиях, чтобы исключить необходимость в специально разработанных этикетках, исследователи использовали другую молекулу для прикрепления мишеней к гелю перед перевариванием. Эта молекула, которую исследователи назвали AcX, коммерчески доступна и, следовательно, значительно упрощает процесс.
AcX можно модифицировать, чтобы закрепить на геле белки или РНК. В исследовании Nature Biotechnology исследователи использовали его для закрепления белков, и они также показали, что метод работает на тканях, которые ранее были помечены либо флуоресцентными антителами, либо белками, такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP).
«Это позволяет использовать полностью готовые детали, а это означает, что его можно очень легко интегрировать в существующие рабочие процессы», – говорит Тилберг. «Мы думаем, что это значительно снизит барьер для людей, использующих эту технику, по сравнению с оригинальным ExM."
При таком подходе сканирование участка ткани размером 500 на 500 на 200 микрон с помощью светового флуоресцентного микроскопа занимает около часа.
Исследователи показали, что этот метод работает для многих типов тканей, включая мозг, поджелудочную железу, легкие и селезенку.
Визуализация РНК
В статье Nature Methods исследователи использовали тот же тип закрепляющей молекулы, но модифицировали ее для нацеливания на РНК. Все РНК в образце прикреплены к гелю, поэтому они остаются на своих исходных местах в течение всего процесса переваривания и размножения.
После расширения ткани исследователи маркируют определенные молекулы РНК, используя процесс, известный как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), который был первоначально разработан в начале 1980-х годов и широко используется. Это позволяет исследователям визуализировать расположение определенных молекул РНК с высоким разрешением в трех измерениях в больших образцах тканей.
Эта повышенная пространственная точность может позволить ученым изучить множество вопросов о том, как РНК способствует клеточной функции. Например, в нейробиологии давний вопрос: как нейроны быстро изменяют силу своих связей, чтобы сохранить новые воспоминания или навыки. Одна из гипотез состоит в том, что молекулы РНК, кодирующие белки, необходимые для пластичности, хранятся в клеточных компартментах рядом с синапсами, готовые к трансляции в белки при необходимости.
С новой системой должна быть возможность точно определить, какие молекулы РНК расположены рядом с синапсами и ждут своей трансляции.
«Люди нашли сотни этих локально переведенных РНК, но трудно понять, где именно они находятся и что делают», – говорит Чен. "Этот метод был бы полезен для изучения этого."
Лаборатория Бойдена также заинтересована в использовании этой технологии для отслеживания связей между нейронами и классификации различных подтипов нейронов на основе того, какие гены они экспрессируют.