«Это первое исследование, которое доказывает, что систему редактирования генов CRISPR / Cas9 можно вводить в терапевтически применимом составе для восстановления генов у живых взрослых животных», – сказал Вэнь Сюэ, доктор философии, доцент молекулярной медицины и член Институт терапии РНК Медицинской школы UMass. "До сих пор было невозможно доставить CRISPR / Cas9 таким образом, чтобы это подходило для клинических испытаний. Используя руководство по РНК и шаблон для репарации ДНК, доставляемый через вирусный вектор, за которым следует Cas9 в липидной наночастице, мы сделали огромный шаг вперед в преодолении этого препятствия."
«Это открытие действительно вдохновляет нас, потому что заставляет думать, что это система репарации генов, которую можно использовать для лечения целого ряда заболеваний – не только тирозинемии, но и других», – сказал старший автор Дэниел Дж.
Андерсон, доктор философии, доцент кафедры химической инженерии Массачусетского технологического института и член Института интегративных исследований рака Коха и Института медицинской инженерии и науки.
CRISPR / Cas9 стал мощным инструментом редактирования генов, который произвел революцию в биомедицинских исследованиях, облегчая инактивацию или активацию генов в клеточной линии для изучения. Адаптивная иммунная система, используемая бактериями для защиты от бактериофагов и других типов чужеродного генетического материала, система состоит из двух компонентов: молекулярного скальпеля (Cas9), который разрезает ДНК, и направляющего комплекса РНК, который разблокирует скальпель при совпадении генетической последовательности. , определяя точное место резания, находится.
Ученые могут перепрограммировать систему CRISPR / Cas9 с помощью искусственных управляющих РНК для расщепления определенных последовательностей в геномах млекопитающих.
Естественные процессы восстановления ДНК клетки снова склеивают геном, часто удаляя небольшую часть. Если исправленная копия мутации болезни также доставляется при выполнении разреза, клетка может сшить геном более плотно с исправленным геном, что приведет к необратимому восстановлению генома и исправлению гена болезни.
Для эффективного использования этой технологии все три этих элемента, включая матрицу репарации ДНК, должны быть эффективно и безопасно доставлены в ядра клеток-мишеней. «Наше предыдущее исследование (опубликованное в 2014 году) показало, что можно исправить генетическую мутацию, вызывающую тирозинемию у мышей, с помощью CRISPR / Cas9, вводимого путем инъекции под высоким давлением», – сказал доктор. Сюэ. «Однако этот подход не подходит для клинического применения, потому что он может вызвать повреждение печени, и нам пришлось бы доставлять ее так много, что мы удвоили бы объем крови."
Тирозинемия 1 типа, также известная как гепаторенальная тирозинемия, вызвана неспособностью метаболизировать аминокислоту тирозин.
Это вызвано мутацией в гене FAH, который кодирует фермент фумарилацетоацетатгидролазу. Это приводит к токсическому накоплению метаболитов в крови и моче, вызывая серьезное повреждение печени и почек.
Лечение заболевания, диагностированного у младенцев, включает ограничение тирозина в рационе, прием препарата нититинон и, в некоторых случаях, трансплантацию печени.
Перед Сюэ и его коллегами стояла задача разработать систему доставки CRISPR / Cas9, которая была бы более эффективной, чем 1 из 250 клеток, которые были восстановлены с помощью инъекции под высоким давлением в предыдущем исследовании, но при этом потенциально более безопасна для применения на людях. Для этого они обратились к двум генетическим системам доставки, которые уже проходят клинические испытания – вектору аденоассоциированного вируса (AAV) и липидной наночастице.
Они загрузили направляющую РНК CRISPR и матрицу генетической репарации в перепрограммированный вектор AAV и ввели его мышам. Поскольку эти генетические материалы доставляются с вирусным вектором, они могут экспрессироваться в течение длительного периода времени, что устраняет необходимость доставлять их одновременно с Cas9. Без РНК-мессенджера Cas9, которая разрезает геном, руководство CRISPR и матрица репарации остаются в клетках неактивными.
Через неделю, после того как клетки печени успеют начать продуцировать направляющую цепь РНК и матрицу ДНК, липидная наночастица используется для доставки матричной РНК Cas9.
Это лучшее средство доставки для РНК Cas9, потому что она обычно слишком велика, чтобы поместиться внутри AAV. Кроме того, когда Cas9 доставляется с вирусным вектором в клетку, он будет продолжать экспрессироваться еще долго после восстановления поврежденной ДНК.
Это увеличивает вероятность нецелевого редактирования, которое потенциально может повредить геном. РНК-мессенджер Cas9 начинает распадаться относительно быстро (в течение нескольких дней) после доставки и обеспечивает кратковременную экспрессию Cas9.
Это значительно снижает риск потенциального сбоя системы CRISPR / Cas9.
Когда эти элементы были доставлены взрослым мышам с тирозинемией типа I, у животных наблюдалось снижение потери веса, уменьшение повреждения печени и образование клеток печени с исправленным геном FAH.
Глубокое секвенирование обработанных клеток печени показало, что 6 процентов из них содержат скорректированный ген FAH – примерно 1 из 16 или 15-кратное улучшение по сравнению с предыдущим исследованием. Это также уменьшило нецелевое разрезание генома в семь раз.
«Мы объединили подходящие для клинической практики невирусные и вирусные системы доставки, чтобы обеспечить эффективную репарацию генов in vivo и минимизировать побочные эффекты», – сказал ведущий автор Хао Инь, доктор философии, научный сотрудник Массачусетского технологического института.
Поскольку векторы AAV уже проходят клинические испытания для лечения других заболеваний человека, доктор. Андерсон имеет аналогичные липидные наночастицы в клинической разработке, исследователи оптимистично настроены в отношении того, что этот метод доставки CRISPR может быть использован на людях, хотя необходимы дополнительные исследования.
«Есть надежда, что, поскольку мы использовали два метода доставки, которые уже находятся в клинической разработке для пациентов, это ускорит путь к клиническим испытаниям CRISPR-лечения тирозинемии типа I», – сказал Сюэ. «Более того, платформа, которую мы разработали, является модульной, поэтому ее потенциально можно адаптировать для лечения других заболеваний, особенно печени."