«Жизнь на Земле во всем ее разнообразии кодируется только двумя парами оснований ДНК, AT и CG, и мы создали организм, который стабильно содержит эти две плюс третью, неестественную пару оснований», – сказал доцент TSRI. Флойд Э. Ромесберг, руководивший исследовательской группой. «Это показывает, что возможны другие решения для хранения информации, и, конечно же, приближает нас к биологии расширенной ДНК, которая будет иметь множество интересных приложений – от новых лекарств до новых видов нанотехнологий."
Отчет о достижении появится 7 мая 2014 года в предварительной публикации журнала Nature.
Множество проблем
Ромесберг и его лаборатория с конца 1990-х годов работали над поиском пар молекул, которые могли бы служить новыми функциональными основаниями ДНК – и, в принципе, могли бы кодировать белки и организмы, которые никогда не существовали раньше.
Задача была непростой.
Любая новая функциональная пара оснований ДНК должна связываться со сродством, сопоставимым со сродством естественных пар нуклеозидных оснований аденин-тимин и цитозин-гуанин. Такие новые основания также должны будут стабильно выстраиваться рядом с естественными основаниями в подобном застежке-молнии отрезке ДНК.
При работе с ферментами природной полимеразы во время репликации ДНК и транскрипции в РНК они должны будут плавно распаковываться и повторно застегиваться. И каким-то образом этим вторгшимся нуклеозидам придется избегать нападения и удаления с помощью естественных механизмов восстановления ДНК.
Несмотря на эти проблемы, к 2008 году Ромесберг и его коллеги сделали большой шаг к этой цели; в исследовании, опубликованном в том же году, они определили наборы нуклеозидных молекул, которые могут соединяться через двухцепочечную ДНК почти так же плотно, как и естественные пары оснований, и показали, что ДНК, содержащая эти неестественные пары оснований, может реплицироваться в присутствии правильных ферментов. В исследовании, которое вышло в следующем году, исследователи смогли найти ферменты, которые транскрибируют эту полусинтетическую ДНК в РНК.
Но эта работа велась в упрощенной среде пробирки. «Эти неестественные пары оснований прекрасно работали in vitro, но большая проблема заключалась в том, чтобы заставить их работать в гораздо более сложной среде живой клетки», – сказал Денис А. Малышев, сотрудник лаборатории Ромесберга, ведущий автор нового отчета.
Микроводоросли ведут к прорыву
В новом исследовании команда синтезировала отрезок кольцевой ДНК, известный как плазмида, и вставила его в клетки обычной бактерии E. кишечная палочка. Плазмидная ДНК содержала естественные пары оснований T-A и C-G, а также наиболее эффективную неестественную пару оснований, обнаруженную лабораторией Ромесберга, две молекулы, известные как d5SICS и dNaM.
Целью было получить E. coli для как можно более нормальной репликации этой полусинтетической ДНК.
Самое большое препятствие может обнадежить тех, кто опасается неконтролируемого высвобождения новой формы жизни: молекулярные строительные блоки для d5SICS и dNaM не находятся в клетках от природы. Таким образом, чтобы получить E. coli, чтобы воспроизвести ДНК, содержащую эти неестественные основания, исследователям пришлось искусственно добавить молекулярные строительные блоки, добавив их в жидкий раствор вне клетки. Затем, чтобы ввести в клетки строительные блоки, известные как нуклеозидтрифосфаты, им пришлось найти специальные молекулы-переносчики трифосфата, которые будут выполнять эту работу.
В конечном итоге исследователям удалось найти переносчик трифосфата, созданный разновидностями микроводорослей, который достаточно хорошо переносил неестественные трифосфаты. «Это был большой прорыв для нас – важный прорыв», – сказал Малышев.
Хотя завершение проекта заняло еще год, таких больших препятствий больше не возникло.
К своему удивлению команда обнаружила, что полусинтетическая плазмида, реплицированная с разумной скоростью и точностью, не сильно препятствовала росту E. coli и не показали никаких признаков потери неестественных пар оснований из-за механизмов восстановления ДНК.
«Когда мы остановили поток неестественных строительных блоков трифосфата в клетки, замена d5SICS-dNaM естественными парами оснований очень хорошо коррелировала с самой репликацией клеток – казалось, что не было других факторов, исключающих неестественное основание. пары из ДНК ", – сказал Малышев. "Важно отметить, что эти два прорыва также обеспечивают контроль над системой. Наши новые основания могут попасть в клетку только в том случае, если мы включим белок-переносчик оснований. Без этого переносчика или когда новые основания не предоставлены, клетка вернется к A, T, G, C, а d5SICS и dNaM исчезнут из генома."
Следующим шагом будет демонстрация внутриклеточной транскрипции новой ДНК с расширенным алфавитом в РНК, которая питает белковые механизмы клеток. «В принципе, мы могли бы кодировать новые белки, сделанные из новых, неприродных аминокислот, что дало бы нам больше возможностей, чем когда-либо, адаптировать белковые терапевтические и диагностические средства и лабораторные реагенты для достижения желаемых функций», – сказал Ромесберг. "Другие применения, такие как наноматериалы, также возможны."
Другими участниками статьи «Полусинтетический организм с расширенным генетическим алфавитом» были Кирандип Дхами, Томас Лаверн и Тинджиан Чен из TSRI, а также Нан Дай, Джереми М. Фостер и Иван Р. Корреа-младший. из Новой Англии Биолабс, Инк.
Исследование частично финансировалось U.S.
Национальные институты здоровья (GM 060005).