Теперь исследователи из Гарвардской медицинской школы, Бостонской детской больницы и Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) продемонстрировали, что новый метод рентгеновской микроскопии может помочь ускорить усилия по картированию нейронных цепей и, в конечном итоге, самого мозга.
Репортаж в Nature Neuroscience в сентябре.
14 команда описывает, как рентгеновскую голографическую нанотомографию (XNH) можно использовать для получения изображений относительно больших объемов мозга мыши и нервной ткани плодовой мушки с высоким разрешением.
В сочетании с анализом изображений на основе искусственного интеллекта они реконструировали плотные нейронные цепи в 3D, всесторонне каталогизируя нейроны и даже отслеживая отдельные нейроны от мышц до центральной нервной системы у дрозофил.
«Мы думаем, что это откроет новые возможности для понимания мозга, как в том, как он организован, так и в схемах, лежащих в основе его функций», – сказал соавтор-корреспондент Вей-Чунг Аллен Ли, доцент кафедры неврологии в Boston Children’s. «Этот тип знаний может дать нам фундаментальное представление о неврологических расстройствах, заболеваниях, влияющих на структуру мозга, и многом другом."
По словам авторов, для биологических вопросов, таких как открытие нейронных цепей, рентгеновская микроскопия имеет несколько преимуществ по сравнению с современными подходами, основанными на электронной микроскопии (ЭМ).
«Мы думаем, что XNH может принести большую пользу нейробиологии, потому что теперь мы можем получить доступ к гораздо большим объемам за более короткое время», – сказала соавтор-корреспондент Александра Пакуряну, ученый из ESRF. "Это начало нового подхода к картированию нейронных цепей."
Около световой скорости
Изучение коннектома – грандиозная задача.
Человеческий мозг, например, содержит около 100 миллиардов нейронов со 100 триллионами нейронных связей, примерно столько же звезд в пределах 1000 галактик.
В моделях на животных ученые достигли значительного прогресса, например, в визуализации всего мозга плодовой мушки, в первую очередь путем получения серийных срезов мозга, каждый в тысячу раз тоньше человеческого волоса, визуализации срезов с помощью ЭМ и объединения изображений для анализа.
Стоимость этого метода может быть непомерно высокой с точки зрения времени и ресурсов, требуя большого количества ЭМ-изображений с узким полем зрения и интенсивных усилий по восстановлению даже небольших нейронных цепей.
По словам авторов исследования, необходимы новые методы визуализации для ускорения таких усилий.
Для этого лаборатория Ли, изучающая организацию и функции нейронных цепей, сотрудничала с Пакуряну, который специализируется на рентгеновской микроскопии и нейровизуализации.
Под руководством соавторов Аарона Куана, научного сотрудника по нейробиологии в HMS, и Джаспера Фелпса, аспиранта Гарвардской программы по нейробиологии, команда сосредоточилась на применении XNH в нервной ткани.
Этот метод работает аналогично компьютерной томографии, при которой используется вращающийся рентгеновский снимок для создания серийных изображений поперечного сечения тела. Напротив, XNH подвергает вращающийся образец ткани воздействию рентгеновских лучей высокой энергии на синхротроне ESRF, который ускоряет электроны до скорости, близкой к световой, вокруг 844-метрового кольца.
В отличие от стандартной рентгеновской визуализации, которая основана на различиях в ослаблении рентгеновского излучения при прохождении луча через ткань, XNH создает изображения на основе вариаций тонких фазовых сдвигов луча, индуцированных образцом.
Последний подход увеличивает чувствительность и, в сочетании с визуализацией в криогенных условиях, помогает сохранить и защитить образец от повреждения рентгеновской энергией.
Изображения, генерируемые XNH, необходимо интерпретировать, чтобы определить, какие структуры являются нейронами. Команда решила эту проблему, применив глубокое обучение – метод искусственного интеллекта, который все чаще используется для таких приложений, как распознавание лиц или объектов.
В качестве доказательства принципа исследователи отсканировали миллиметровые объемы нервной ткани мышей и плодовых мух и реконструировали трехмерные изображения, достигнув разрешения около 87 нанометров.
Этого было достаточно, чтобы всесторонне визуализировать нейроны и проследить отдельные нейриты, проекции нейронов, которые образуют проводку нейронных цепей.
Важно отметить, что для создания этих реконструкций потребовалось несколько дней, по сравнению с месяцами или годами, которые могут потребоваться для восстановления аналогичных объемов с использованием серийных ЭМ-секций.
Форма функционировать
В мозгу мыши команда исследовала область коры головного мозга, участвующую в интеграции сенсорных стимулов и принятии перцептивных решений. Предыдущие электромагнитные исследования отметили интересные структурные характеристики так называемых пирамидных нейронов в этой области, но были ограничены размером выборки около 20 нейронов на набор данных из-за ограничений в поле зрения.
Используя XNH, исследователи отсканировали более 3200 клеток в этой области. В сочетании с согласованными данными ЭМ команда охарактеризовала структуру и взаимосвязь сотен пирамидных нейронов, которые выявили различные структурные свойства, такие как сильные и пространственно сжатые тормозные входы в определенных областях нейритов, которые предполагают уникальные и ранее не описанные функциональные свойства.
«Возможность визуализировать нейроны помогает нам понять организационные принципы мозга и то, как различные схемы или сети могут выполнять вычисления, необходимые для поведения», – сказал Ли, исследователь из Центра нейробиологии Кирби в Бостонском детском центре. "Затем мы можем провести дальнейшие эксперименты, чтобы связать структурные данные с функциональными экспериментами, чтобы попытаться напрямую ответить на этот вопрос."
Они также визуализировали нейроны, содержащиеся в ноге плодовой мушки, структуру, которую трудно разделить и изучить с помощью ЭМ. С помощью XNH они смогли отобразить все мотонейроны, простирающиеся от мухи-эквивалента спинного мозга до ноги, а также сенсорные нейроны, которые передают сигналы в центральную нервную систему.
«Этот метод ранее применялся к нервной ткани, но никогда не достиг такого уровня качества и разрешения», – сказал Пакуряну, в прошлом приглашенный научный сотрудник отделения нейробиологии Института Блаватника при HMS. «Мы показали, что можем достичь достаточного разрешения, чтобы отслеживать нейриты и продвигать исследования в направлении коннектомов."
В настоящее время исследователи работают над улучшением и дальнейшей оптимизацией XNH для визуализации биологических тканей.
Текущее разрешение, достигаемое с помощью этого метода, еще недостаточно высоко для визуализации синапсов, что в настоящее время требует согласованных данных ЭМ для изучения.
Однако, по словам авторов, физические пределы этого метода далеки от достижения, и усилиям по увеличению разрешения будет способствовать рентгеновский источник следующего поколения, недавно введенный в эксплуатацию в ESRF.
«Рентгеновская микроскопия имеет особые преимущества, и одна из наших целей – применить ее к более крупным сетям нейронных связей с более высоким разрешением», – сказал Ли. "Надеюсь, что когда-нибудь мы сможем помочь в решении таких вопросов, как, например, можем ли мы понять нейронные цепи, которые лежат в основе сложного поведения, такого как принятие решений? Можем ли мы получить вдохновение для более эффективных компьютерных алгоритмов и искусственного интеллекта?? Можем ли мы реконструировать алгоритмы мозга?"
Дополнительными авторами исследования являются Логан Томас, Три Нгуен, Джули Хан, Чао-Лин Чен, Энтони Азеведо, Джон Тутхилл, Ян Функе и Питер Клоутенс.
Работа поддержана Национальным институтом здравоохранения (грант R01NS108410), Фондом Эдварда Р. и Энн Дж.
Lefler Center for the Study of Neurodegenerative Disorders and the Goldenson Family and European Research Council (грант 852455).