Используя новую технику доставки, исследователи смогли вырезать определенные гены примерно в 80 процентах клеток печени, что является лучшим показателем успеха, когда-либо достигнутым с помощью CRISPR у взрослых животных.
«Что действительно интересно здесь, так это то, что мы показали, что вы можете создать наночастицу, которую можно использовать для постоянного и специального редактирования ДНК в печени взрослого животного», – говорит Дэниел Андерсон, доцент кафедры химической инженерии Массачусетского технологического института. член Института интегративных исследований рака Массачусетского технологического института им. Коха и Института медицинской инженерии и науки (IMES).
Один из генов, на которые нацелено это исследование, известный как Pcsk9, регулирует уровень холестерина.
Мутации в человеческой версии гена связаны с редким заболеванием, называемым доминантной семейной гиперхолестеринемией, и недавно FDA одобрило два препарата на основе антител, которые ингибируют Pcsk9. Однако эти антитела необходимо принимать регулярно и в течение всей остальной жизни пациента, чтобы обеспечить лечение. Новые наночастицы навсегда редактируют ген после однократного лечения, и этот метод также предлагает многообещающие возможности для лечения других заболеваний печени, по словам команды MIT.
Андерсон – старший автор исследования, опубликованного в ноябре.
13 выпуск журнала Nature Biotechnology. Ведущий автор статьи – научный сотрудник Института Коха Хао Инь.
Среди других авторов Дэвид Х. Профессор Института Коха Роберт Лангер из Массачусетского технологического института, профессора Виктор Котелянский и Тимофей Зацепин из Сколковского института науки и технологий и профессор Вэнь Сюэ из Медицинской школы Массачусетского университета.
Целенаправленная болезнь
Многие ученые пытаются разработать безопасные и эффективные способы доставки компонентов, необходимых для CRISPR, который состоит из фермента, расщепляющего ДНК, называемого Cas9, и короткой РНК, которая направляет фермент в определенную область генома, направляя Cas9, где его резать.
В большинстве случаев исследователи полагаются на вирусы, несущие ген Cas9, а также на направляющую цепь РНК.
В 2014 году Андерсон, Инь и их коллеги разработали невирусную систему доставки, впервые продемонстрировав лечение болезни (тирозинемии, связанной с нарушением функции печени) с помощью CRISPR у взрослого животного. Однако для этого типа доставки требуется инъекция под высоким давлением, метод, который также может вызвать некоторое повреждение печени.
Позже исследователи показали, что могут доставлять компоненты без инъекции под высоким давлением, упаковывая информационную РНК (мРНК), кодирующую Cas9, в наночастицу вместо вируса. Используя этот подход, при котором направляющая РНК все еще доставлялась вирусом, исследователи смогли отредактировать целевой ген примерно в 6 процентах гепатоцитов, что достаточно для лечения тирозинемии.
Хотя этот метод доставки многообещающий, в некоторых ситуациях было бы лучше иметь полностью невирусную систему доставки, говорит Андерсон. Одно из соображений заключается в том, что после использования определенного вируса у пациента вырабатываются антитела к нему, поэтому его нельзя использовать снова.
Кроме того, у некоторых пациентов уже есть антитела к вирусам, которые тестируются в качестве средств доставки CRISPR.
В новой статье Nature Biotechnology исследователи придумали систему, которая предоставляет как Cas9, так и руководство по РНК с использованием наночастиц, без необходимости в вирусах. Чтобы доставить направляющие РНК, им сначала нужно было химически модифицировать РНК, чтобы защитить ее от ферментов в организме, которые обычно расщепляют ее, прежде чем она сможет достичь места назначения.
Исследователи проанализировали структуру комплекса, образованного Cas9 и РНК-проводником, или sgRNA, чтобы выяснить, какие участки цепи направляющей РНК можно химически модифицировать, не мешая связыванию двух молекул.
На основе этого анализа они создали и протестировали множество возможных комбинаций модификаций.
«Мы использовали структуру комплекса Cas9 и sgRNA в качестве руководства и провели тесты, чтобы выяснить, что мы можем модифицировать до 70 процентов направляющей РНК», – говорит Инь. «Мы могли бы сильно изменить его и не повлиять на связывание sgRNA и Cas9, и эта усиленная модификация действительно усиливает активность."
Перепрограммирование печени
Исследователи упаковали эти модифицированные направляющие РНК (которые они называют усиленной sgRNA) в липидные наночастицы, которые они ранее использовали для доставки других типов РНК в печень, и вводили их мышам вместе с наночастицами, содержащими мРНК, кодирующую Cas9.
Они экспериментировали с отключением нескольких различных генов, экспрессируемых гепатоцитами, но сосредоточили большую часть своего внимания на регулирующем холестерин гене Pcsk9. Исследователям удалось устранить этот ген более чем в 80% клеток печени, а белок Pcsk9 у этих мышей не обнаруживался. Они также обнаружили 35-процентное снижение общего уровня холестерина у обработанных мышей.
В настоящее время исследователи работают над выявлением других заболеваний печени, которым может быть полезен этот подход, и продвигают эти подходы к использованию у пациентов.
«Я думаю, что наличие полностью синтетической наночастицы, которая может специально отключать гены, может быть мощным инструментом не только для Pcsk9, но и для других заболеваний», – говорит Андерсон. «Печень – действительно важный орган, а также источник болезней для многих людей. Если вы можете перепрограммировать ДНК своей печени, пока вы ее все еще используете, мы думаем, что есть много болезней, с которыми можно было бы бороться."
«Мы очень рады видеть, что это новое приложение нанотехнологий открывает новые возможности для редактирования генов», – добавляет Лангер.