Ученые NIST установили цель, в которой одобренный препарат против ВИЧ – эфавиренц – захватывает фермент, уже отвечающий за примерно 80% выведения холестерина из мозга человека. Полученная с помощью передовой технологии замещения атомов, называемой водородно-дейтериевым обменом (HDX), молекулярная дорожная карта показывает, как небольшие количества препарата могут ускорить работу фермента CYP46A1.
Обладая этой информацией, команда под руководством Ирины Пикулевой из Университета Кейс Вестерн Резерв теперь имеет полную историю механизма действия препарата и ключевые доказательства в своем предложении о запуске клинических испытаний эфавиренца в качестве средства для лечения болезни Альцгеймера. Аналитическое расследование, которое выявило динамику связи, очищающей холестерин, было сообщено в недавнем выпуске Journal of Biological Chemistry.
Анализ данных NIST по HDX и последующие эксперименты помогли объяснить, почему при исследованиях на мышах крошечные дозы эфавиренца увеличивали способность CYP46A1 к удалению холестерина, в то время как большие дозы оказывали ингибирующий эффект.
Объяснение: в низких дозах эфавиренц связывается с участком фермента, который усиливает расщепление холестерина на другом участке фермента, что обусловлено изменениями формы, инициированными препаратом. Однако при более высоких дозах молекулы лекарства начинают конкурировать с холестерином за то же место, где холестерин обычно связывается.
Эффект изменения формы эфавиренца "является классическим примером основного принципа биологии – структура определяет функцию", – сказала Пикулева. И эффект может быть драматичным.
В исследованиях на мышах соединение фермента с лекарством вызывало 40-процентное увеличение распада холестерина и его удаления из мозга. По словам Пикулева, у людей повышение, вероятно, будет значительно выше, поскольку фермент играет большую роль в утилизации в мозге человека, чем в мозге мыши.
Исследования, проведенные за последние 15 лет, убедили команду Пикулевой следовать стратегии лечения болезни Альцгеймера, направленной на усиление способности CYP46A1, части большого семейства железосодержащих ферментов, сильно влияющих на то, как организм перерабатывает лекарственные препараты, очищать холестерин от холестерина.
Исследования других ученых, которые использовали генетические манипуляции на мышиных моделях болезни Альцгеймера, показали, что увеличение активности CYP46A1 снижает образование бляшек или скоплений белковых кусочков, называемых бета-амилоидами. В этих исследованиях также сообщалось об улучшении памяти и обучения. И даже у нормальных мышей без бляшек повышенное удаление холестерина привело к улучшению памяти.
И наоборот, исследования на мышах также показали, что подавление CYP46A1 приводит к дефициту обучения.Сосредоточившись на эфавиренце в рамках своей стратегии "перепрофилирования" уже одобренных препаратов, команда Case Western решила выяснить, как препарат стимулирует активность фермента. Компьютерное моделирование и моделирование предложили более 30 мест на ферменте, где молекула эфавиренца может связываться.
Пытаясь отсеять варианты, Пикулева обратилась к Кайлу Андерсону и его коллегам из Института биологических и биотехнологических исследований, партнерства между NIST и Университетом Мэриленда.
В HDX-анализе белки погружаются в «тяжелую воду», в которой нормальный водород, содержащий единственный протон в своем ядре, заменяется дейтерием, более редким типом водорода, ядро которого содержит как протон, так и нейтрон.
Белок и тяжелая вода обменивают водород и дейтерий. Поскольку белок заменяет водород на более тяжелый дейтерий, его масса увеличивается. Процесс включает в себя серию шагов, которые включают гашение или блокирование дейтерия в белке, а затем разбиение белка на электрически заряженные фрагменты для анализа.
С помощью устройства, называемого масс-спектрометром, исследователи могут измерить массу этих фрагментов, чтобы определить, насколько быстро эти кусочки белка обменивают водород на дейтерий. Фрагмент белка, который в значительной степени подвергается воздействию воды, будет иметь высокую скорость обмена, но фрагмент, который исходит из места, скрытого внутри белка или покрыт молекулой, связывающейся с белком, будет иметь более медленную скорость обмена.
«Масс-спектрометрия HDX открывает окно, которое позволяет вам узнать, как белки ведут себя в физиологически значимых условиях», – пояснил Андерсон. "Он представляет собой кусочки пазла, которые вы можете собрать, чтобы показать, как их трехмерная форма меняется с течением времени."
Команда NIST использовала HDX для сравнения и сопоставления CYP46A1 в четырех различных состояниях: только с холестерином, только с эфавиренцем и с холестерином и эфавиренцем.
Последующий анализ результирующих потоков экспериментальных данных – вычислительно-интенсивный процесс, который Андерсон выполнил в трех экземплярах для обеспечения точности – выявил не только то, где лекарство прикрепляется к ферменту, но и то, как сайт связывания холестерина регулируется в ответ. Структурные изменения позволили CYP46A1 более прочно связывать молекулы холестерина, чем в отсутствие препарата.
После исследования с использованием другого метода команда Пикулевой дополнительно подтвердила сайт связывания эфавиренца, определенный с помощью HDX. По ее словам, данные убедительно свидетельствуют о том, что в дозах, в сто раз меньших, чем предписано для лечения ВИЧ, эфавиренц может быть эффективным средством для стимуляции обмена холестерина из мозга и замедления или предотвращения болезни Альцгеймера.
Пикулева и его коллеги сейчас пытаются получить финансирование для клинических испытаний на людях, чтобы изучить эффекты малых доз эфавиренца.