Примите препарат, снижающий уровень холестерина, симвастатин. Впервые представленный на коммерческой основе как Zocor, статиновый препарат приносил миллиарды долларов ежегодных продаж. В 2011 году ученые и коллеги из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе обнаружили, что мутировавший фермент может помочь в производстве столь востребованного фармацевтического препарата намного эффективнее, чем химический процесс, который использовался в течение многих лет, и может сделать это лучше, чем естественная, немутантная версия фермента. фермент. Но никто не знал почему, пока другая команда исследователей UCLA не раскрыла тайну.
Используя комбинацию экспериментальных измерений и обширного компьютерного моделирования, многопрофильная группа исследователей из трех лабораторий химии, биохимии и химической инженерии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе обнаружила важные структурные особенности, скрытые в модифицированном ферменте, которые помогли им раскрыть секрет его эффективности. Их результаты будут опубликованы в июньском печатном выпуске журнала Nature Chemical Biology и в настоящее время доступны в Интернете.
Как впервые был открыт ферментный катализатор
Симвастатин уже получил широкое распространение, когда ученые обнаружили, что природный фермент под названием LovD, первоначально полученный из плесени, обнаруженной в почве, может реагировать и производить лекарство, подобное симвастатину. Однако скорость его реакции в качестве катализатора была слишком низкой для промышленного производства.
Итак, профессор Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе И Тан сотрудничал с учеными из Codexis Inc., разработчик промышленных ферментов и использовал процесс, называемый «направленная эволюция», для создания мутированной версии фермента, которая была лучше, быстрее и стабильнее для промышленного использования.
«Направленная эволюция – это лабораторный метод, который имитирует естественный процесс эволюции, но гораздо более быстрым способом», – сказал Танг, занимающий двойные должности в отделе химии и биохимии и отделении химической и биомолекулярной инженерии.
Лаборатория Танга и команда Codexis создали случайно мутировавшие версии LovD, каждая из которых имеет немного отличающуюся последовательность аминокислот, которая изменила его основную форму и функцию. Затем команда выбрала те ферменты, которые наиболее способны производить симвастатин, и повторила процесс, чтобы еще больше повысить их реактивность.
После девяти раундов направленной эволюции они идентифицировали мутировавший фермент, который они назвали LovD9, который отличается от исходного фермента LovD посредством 29 различных мутаций и который производит симвастатин в 1000 раз более эффективно, чем природный фермент.
«Симвастатин имеет несколько сложных структурных особенностей, поэтому попытка химического синтеза требует времени и денег», – сказал Гонсало Хименес-Осес, научный сотрудник Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и первый автор статьи. "Если вы сможете производить эти соединения простым способом, это станет огромным улучшением для производства лекарств."
До разработки фермента LovD9 симвастатин производился с помощью многоступенчатого процесса с использованием дорогих и опасных химических реагентов и растворителей; введение LovD9 в производственный процесс в 2012 году изменило все это, в результате чего появилась гораздо более эффективная и экологически чистая альтернатива химическому процессу производства.
«Поскольку это ферментативный процесс, в нем не используются токсичные химические вещества или избыточные органические растворители», – сказал Тан, получивший в 2012 году награду EPA Presidential Green Chemistry Challenge за свою работу с Codexis.
Хотя изготовление симвастатина с использованием LovD9 дало явные преимущества, причины, по которым мутировавший фермент работал намного лучше, чем природный, оставались неясными. Поэтому Тан обратился к своим коллегам Кендаллу Хоуку и Тодду Йейтсу, профессорам химии и биохимии в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, чтобы узнать, смогут ли они объединить свои знания и найти объяснение.
Раскрытие структурной тайны
«Есть много различных примеров направленной эволюции, используемой для производства катализаторов, которые увеличивают скорость коммерческих или синтетических процессов, но тот факт, что у вас есть хороший катализатор, не дает вам никакой информации о том, как он работает», – сказал Хоук.
Чтобы определить молекулярные структуры как LovD, так и LovD9, лаборатория Йейтса выращивала кристаллы белка из каждого фермента и рассеивала от них рентгеновские лучи в процессе, называемом рентгеновской кристаллографией. Эти измерения позволили Йейтсу подробно изучить молекулярную архитектуру ферментов, но оба оказались практически идентичными, без явных структурных изменений, объясняющих, почему LovD9 был более эффективным.
Хотя два фермента могут казаться похожими, когда находятся в твердой кристаллической форме, они ведут себя совершенно по-разному при погружении в воду, сказал Хоук. Ферменты состоят из длинных цепочек аминокислот, которые могут вращаться и скручиваться, когда им позволяют свободно перемещаться, но это сложное движение нелегко наблюдать в лабораторных экспериментах.
Для количественной оценки этих мельчайших молекулярных флуктуаций Хоук и Хименес-Осес использовали компьютерную программу, которая моделирует, как мутировавшие и природные ферменты претерпевают внутренние движения при растворении в воде, и как это движение будет влиять на способность ферментов вызывать преобразование, при котором синтезируется симвастатин.
Определение того, почему мутировавший фермент LovD9 работает лучше, чем его естественный аналог, включал моделирование движения сложного фермента в жидкой среде в течение всего микросекунд.
По словам Хоука, микросекунда может показаться очень коротким промежутком времени, но вычисления движения такой большой молекулы требуют огромных вычислительных ресурсов.
Команда смогла использовать огромную вычислительную мощность, необходимую для этих вычислений, с помощью суперкомпьютера Anton, разработанного Национальным научным фондом США. E. Лаборатория Shaw Research, расположенная в Питтсбургском суперкомпьютерном центре.
«В машинах, которые у нас есть для наших рутинных расчетов, каждое моделирование в этом масштабе времени занимает более одного месяца», – сказал Хименес-Осес. «Используя Антона, мы можем сделать столько же вычислений за один день.
Это огромное улучшение."
По результатам компьютерного моделирования Хоук и Хименес-Осес определили, что часть того, что делает мутировавший фермент настолько эффективным, заключается в том, что он может функционировать без участия дополнительного белка, необходимого для естественного фермента. Кроме того, мутировавший фермент движется и скручивается таким образом, что он гораздо чаще остается в конфигурации, полезной для производства симвастатина, чем его естественный аналог.
Эти расчеты позволили исследовательской группе понять, как мутации, расположенные далеко от активной части фермента, могут улучшить его производительность.
«Направленная эволюция изменяет природу аминокислот, содержащихся в белке», – сказал Хоук. «Моделирование молекулярной динамики позволило нам проследить, как эти изменения в аминокислотах изменили структуру белка и сделали его подходящим для использования в качестве катализатора."
В случае LovD9 эти небольшие различия делают реакцию производства симвастатина намного более эффективной. Теперь, когда они знают, какие структурные особенности мутировавшего фермента помогают улучшить производство симвастатина, команда надеется напрямую создать фермент с аналогичными свойствами, не прибегая к более случайному процессу направленной эволюции.
«Особенностью этого исследования было то, что мы проанализировали, что произошло во время направленной эволюции, чтобы попытаться понять, как эти улучшения происходят внутри белка», – сказал Йейтс. "Мы надеемся, что в будущем, возможно, удастся улучшить ферменты рациональными способами, поняв, как это происходит случайным образом."
Тайна мутировавшего фермента LovD9, возможно, осталась бы нерешенной без необычайной степени сотрудничества между исследователями химии и биохимии из разных отделов Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.
«Этот проект не мог бы быть завершен, если бы четыре группы не собрались вместе, чтобы попытаться решить действительно сложную проблему, объединив их различные специальности и методы», – сказал Хименес-Осес. «Собрав по кусочкам эту головоломку с точки зрения биохимии, инженерии, структуры и молекулярной динамики, можно было прийти к довольно целостной картине того, как в данном случае работал процесс направленной эволюции», – добавил Йейтс.