Знание этой структуры, называемой цитоплазматическим хвостом белка gp41, поможет исследователям глубже понять, как вирус заражает клетки человека и как дочерние вирусы собираются и высвобождаются из инфицированных клеток. Цитоплазматический хвост, по-видимому, играет ключевую роль в сборке вируса, помогая встроить структуры шипов оболочки в поверхность вирусных частиц.
«Если мы можем ингибировать включение белка оболочки, мы подавляем репликацию вируса», – сказал Саад. "Это обезвредит вирус и предотвратит болезнь. Цитоплазматический хвост – критический компонент инфекционности."
По словам Саада, доцента микробиологии UAB, структура цитоплазматического хвоста gp41 была чрезвычайно сложной задачей.
"Это был самый сложный проект, с которым я столкнулся за последние 20 лет. Много раз я собирался уйти, но у меня очень настойчивая лабораторная группа."
Саад знает множество других исследовательских групп, которые не смогли определить молекулярную структуру.
Одна проблема для Саада и его коллег из UAB возникла, когда они пытались экспрессировать цитоплазматический хвост gp41 в растущем E. клетки кишечной палочки.
Вместо интактного продукта бактериальный фермент разрезал белок во время экспрессии белка. «Мы никогда не видели этого ни для одного другого белка», – сказал Саад. Исследователи обнаружили, что им пришлось ограничить экспрессию белка всего двумя часами. Даже тогда 70 процентов цитоплазматического хвоста было вырезано и только 30 процентов осталось нетронутым.
По словам Саада, чтобы получить хороший продукт, потребовалось более двух лет и усилий со 100 различными условиями. "Теперь мы можем сделать это за два дня."
Срез оказался полезным. Один кусок был растворим, и группа Саад смогла изучить его структуру с помощью ядерного магнитного резонанса или ЯМР.
Другой кусок был нерастворим, поэтому исследователям пришлось использовать раствор мицелл – диспергированных липидных или детергентоподобных агрегатов в растворе – чтобы нерастворимый кусок сформировал свою структуру в мембраноподобной среде. Как и в случае с условиями роста, исследователям потребовалось множество испытаний, чтобы найти подходящие мембранные условия. Раствор мицелл чем-то похож на уксус и масло после сильного встряхивания, чтобы рассеять крошечные капельки масла по всей повязке.
Опять же, ЯМР был использован для определения нерастворимой структуры при включении в мицеллы.
Когда группа Саад поместила молекулы интактного полноразмерного цитоплазматического хвоста gp41 в раствор мицелл, они обнаружили, что структуры каждой из частей сохраняются в интактной структуре.
Они обнаружили, что N-концевой конец цитоплазматического хвоста gp41, состоящий из 45 аминокислотных остатков, лишен регулярной вторичной структуры и не связан с мембраной, которая обвивает вирусную частицу ВИЧ-1, как кожаный чехол бейсбольного мяча.
С-конец цитоплазматического хвоста gp41, имеющий 105 аминокислотных остатков, был тесно связан с мембраной и имел три альфа-спирали с частями, которые были гидрофобными, и частями, которые были гидрофильными. Группа UAB также показала предпочтительную топологию цитоплазматического хвоста при связывании с мембраной.
Саад говорит, что структура открывает совершенно новые области исследований: как цитоплазматический хвост стабилизирует структуру белка оболочки, как он влияет на подвижность мембран структуры белка оболочки и как он помогает координировать связывание с мембраной и ассоциацию 2000 Gag ВИЧ-1. полипротеины под поверхностью мембраны. Полипротеины Gag позже разрезаются внутри созревающего вируса, чтобы сформировать несколько более мелких белков матрицы, капсида и нуклеокапсида, которые производят конденсированное вирусное ядро.
Саад говорит, что знание структуры цитоплазматического хвоста gp41 также позволит провести сравнительные исследования 10 различных ретровирусов с похожими хвостами, чтобы узнать, почему некоторые хвосты короче, а некоторые длиннее.
«Цитоплазматический хвост gp41 вызывает интерес в течение долгого времени, и никто не понимает, как он действует при инфекции или как помогает встроить белок оболочки в мембрану», – сказал Саад.