Нагоя, Япония – Группа животных-биологов и химиков из Института трансформирующих биомолекул (ITbM) Университета Нагои использовала высокопроизводительный химический скрининг существующих лекарств и биоактивных соединений, чтобы изучить их влияние на циркадные ритмы. исследование опубликовано в журнале EMBO Molecular Medicine. Исследователям удалось идентифицировать различные хитовые соединения, которые могут регулировать циркадный ритм в клетках человека, в том числе хорошо известную антивозрастную добавку, которая способна уменьшить смену часовых поясов у мышей.
Эксперименты проводились в рамках совместного исследовательского сотрудничества между исследователями ITbM, Национального института фундаментальной биологии, Медицинского университета префектуры Киото и Университета Киндай.
Многие часто летающие люди, путешествующие через часовые пояса, как правило, страдают от смены часовых поясов, что вызвано несоответствием между внешними временными сигналами (смещенный дневной / ночной цикл) и их биологическими (циркадными) часами. Циркадные часы у людей имеют приблизительный 24-часовой ритм, и циркадный ритм играет важную роль в регулировании циклов сна / бодрствования, секреции гормонов и метаболизма.
Следовательно, хроническое нарушение циркадного ритма из-за смены часовых поясов или сменной работы (циркадная десинхрония) может приводить к различным симптомам, таким как нарушения сна, ожирение и повышенный риск рака в долгосрочной перспективе.
Хотя нарушение биоритма обычно вызывает ряд нежелательных симптомов, эффективных лекарств или добавок для его лечения в настоящее время мало. Большинство лекарств, открытых к настоящему времени циркадными биологами, которые уменьшают смену часовых поясов у мышей, требуют инъекции препарата в определенный участок мозга, что не очень практично.
Такаши Йошимура, биолог и профессор ITbM Университета Нагои, решил использовать стратегию перепрофилирования лекарств, метод определения новых функций для существующих биологически активных соединений, для поиска соединений, которые могут регулировать циркадные часы и могут быть полезны для лечения. смены часовых поясов.
Разработка новых фармацевтических препаратов, как правило, требует больших затрат и времени, что подтверждается данными, показывающими, что одно лекарство стоит 2–3 миллиарда долларов США и в среднем выходит на рынок в течение 13–15 лет. Поэтому перепрофилирование лекарств – популярный подход к разработке новых лекарств. Известные примеры перепрофилирования лекарств включают переработку миноксидила, первоначально выпущенного на рынок как сосудорасширяющее средство, предназначенное для роста волос, а также силденафил, гипотензивное средство, перепрофилированное для лечения эректильной дисфункции и продаваемое как Виагра.
«В 2015 году мы сообщили о синтезе молекулы с продемонстрированной активностью по сокращению периода на циркадных часах млекопитающих, обнаруженной в результате сотрудничества хронобиологов ITbM, химиков-синтетиков и ученых-теоретиков», – говорит Йошимура. «К сожалению, это соединение было довольно токсичным, что заставило меня больше задуматься о безопасности молекул. Затем я подумал, что перепрофилирование лекарств было бы лучшим подходом для определения соединений, которые можно было бы использовать для лечения смены часовых поясов, поскольку токсичность и способ действия существующих лекарств уже были бы исследованы."
Исследовательская группа провела высокопроизводительный скрининг более 1000 соединений, состоящих из существующих лекарств, в том числе одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, Европы или Азии, а также лекарств, находящихся в клинических испытаниях, для поиска лекарств, которые могут регулировать циркадный ритм. ритм у млекопитающих.
Исследования циркадных часов продолжаются в течение многих десятилетий и привели к открытию молекулярных механизмов, контролирующих циркадный ритм, за что в 2017 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. Почти все клетки нашего тела содержат циркадные часы и в основном контролируются центральным циркадным кардиостимулятором, расположенным в гипоталамусе головного мозга. Циркадные часы, содержащиеся в большинстве тканей и клеток, управляются петлями транскрипционно-трансляционной обратной связи, состоящими из генов и белков циркадных часов.
Два часовых белка, CLOCK (белок капут выходных циклов циркадного локомотера) и BMAL1 (Brain and Muscle Arnt-like1) связываются друг с другом с образованием гетеродимерного комплекса, который затем связывается с последовательностью ДНК, называемой E-box (CACGTG), расположенной в верхняя область часовых генов Per (период) и Cry (криптохром), присутствующих в геноме. Это активирует транскрипцию и трансляцию генов Per и Cry, что приводит к генерации часовых белков PER и CRY. Белки PER и CRY образуют димер, который затем ингибирует их активаторы транскрипции, CLOCK и BMAL1. Активация и ингибирование часовыми генами и белками образует петлю транскрипционно-трансляционной обратной связи, которая завершает цикл один раз в день, создавая, таким образом, 24-часовой циркадный ритм в различных физиологических и поведенческих процессах.
Исследовательская группа провела скрининг различных библиотек лекарств, настроив систему, в которой они наблюдали ежедневную транскрипцию часового гена Bmal1 посредством мониторинга биолюминесцентного ритма с использованием гена биолюминесценции (люциферазы) светлячка. Каждое лекарство добавляли в 384-луночный планшет, содержащий клетки человека (U2OS), трансфицированные геном люциферазы.
В результате высокопроизводительного скрининга более 1000 существующих лекарств команда обнаружила 59 хитовых соединений, влияющих на биолюминесцентный ритм. Среди этих препаратов 46 соединений удлиняли циркадный период, а 13 соединений сокращали его.
Эти хитовые соединения содержат биоактивные молекулы, которые используются в качестве противораковых, антибактериальных и противозачаточных средств, гормонов, витаминов, а также для лечения заболеваний, связанных с центральной нервной системой, пищеварительной системой, сердцем и кожей. Результаты их исследований показывают, что примерно 5% лекарств, имеющихся в настоящее время на рынке, могут оказывать некоторое влияние на наши циркадные ритмы, в зависимости от их дозы и продолжительности приема.
«Я был очень взволнован, когда обнаружил хитовые соединения, которые меняют периоды на клетки человека, и хотел немедленно протестировать их на мышах, чтобы увидеть, могут ли препараты облегчить симптомы смены часовых поясов», – говорит Йошимура. «Многие члены нашей группы колебались, так как они думали, что эффекты, наблюдаемые в клетках, были слишком малы, но я не сомневался, что результаты будут переведены с клеточного уровня (in vitro) на уровень животных (in vivo)."
Для большинства путешественников, летящих на запад (e.грамм. из Азии в Европу), который задерживает циркадные часы, не вызывает особых проблем со здоровьем.
С другой стороны, летя на восток (e.грамм. из Азии в Америку), который ускоряет циркадные часы, заставляет людей просыпаться раньше, чем обычно, и, как правило, вызывает серьезные симптомы смены часовых поясов, такие как усталость и бессонница. Поэтому Йошимура и его группа решили исследовать соединения, сокращающие циркадный цикл, которые ускоряют циркадные часы и облегчают симптомы смены часовых поясов при путешествии на восток.
Среди 13 соединений, сокращающих циркадный цикл, которые идентифицировала группа, исследователи сосредоточились на стероидном гормоне дегидроэпиандростероне (DHEA), который коммерчески доступен в качестве антивозрастной добавки в США. У людей DHEA вырабатывается в надпочечниках, гонадах и головном мозге и является предшественником тестостерона и эстрогена.
ДГЭА – один из самых распространенных гормонов, циркулирующих в кровотоке, но его концентрация обычно снижается с возрастом. Вот почему DHEA продается как добавка для борьбы со старением и для ускорения метаболизма.
Дальнейшие исследования показали, что DHEA сокращает период циркадных часов в культивируемых человеческих клетках дозозависимым образом.
Команда обнаружила, что DHEA ускоряет циркадный ритм в клетках человека, а также в культивируемых клетках и тканях мышей. Поскольку предыдущие исследования продемонстрировали безопасность перорального введения ДГЭА мышам, были проведены эксперименты, чтобы проверить, влияет ли ДГЭА на циркадный ритм мышей.
«Когда мы скармливали мышам DHEA, смешанный с порошковой пищей, мы были удивлены и обрадованы, обнаружив, что DHEA сокращает циркадный период у мышей», – говорит Кэтрин Тамай, научный сотрудник группы профессора Йошимуры, которая в основном проводила эксперименты. «Затем мы провели эксперимент по смене часовых поясов, в котором мы поместили мышей в свет / темноту, а затем продлили цикл на 6 часов, что похоже на сдвиг во времени, возникающий при путешествии из Японии на Аляску.
Мыши с реактивной задержкой, которых кормили DHEA, по-видимому, восстанавливались и адаптировались к новому часовому поясу быстрее, чем мыши, которых кормили обычной пищей. В среднем мыши, получавшие DHEA, оправлялись от смены часовых поясов примерно за 2-3 дня, тогда как мышам без DHEA потребовалось около 5-6 дней, чтобы их деятельность адаптировалась к новому циклу свет / темнота », – описывает она.
«Я начал это исследование в 2016 году, и, будучи биологом, который работал в основном с рыбами, я сначала боялся тестировать лекарства на мышах, но профессор Йошимура был очень оптимистичен и уверен, что этот эксперимент сработает, и его настойчивость окупилась , – говорит Тамай.
Кажется, что простое решение состоит в том, чтобы принять DHEA, чтобы вылечить смену часовых поясов, но одна важная проблема заключается в том, что уровни циркулирующего DHEA у мышей и людей различаются. Причина, по которой DHEA может быть настолько эффективным у мышей, может заключаться в том, что начальная циркулирующая концентрация DHEA значительно ниже у мышей (примерно 15%) по сравнению с людьми.
Кроме того, чрезвычайно высокие дозы DHEA фактически привели к удлинению циркадного периода. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для оценки фактической эффективности ДГЭА для лечения смены часовых поясов у людей.
«Наши исследования показали, что ДГЭА, вероятно, действует в первую очередь на периферические циркадные часы, а не на главные часы в центральной нервной системе, которая контролирует часы всего тела», – объясняет Йошимура. "Чтобы полностью уменьшить смену часовых поясов, необходимо отрегулировать как центральные, так и периферические циркадные часы. Мы предполагаем, что ДГЭА может быть эффективным при приеме вместе с другим лекарством, которое действует на центральные циркадные часы."
Используя перепрофилирование лекарств, группа Йошимуры не только определила препараты, изменяющие циркадный ритм, но также смогла идентифицировать гены, которые участвуют в регуляции циркадных часов. Группа определила несколько ингибиторов тирозинкиназы, которые влияют на циркадные ритмы, и обнаружила доказательства, свидетельствующие о том, что протеинкиназы ABL (мышиный лейкоз Абельсона) и BCR (область кластера точки останова) участвуют в регуляции циркадных часов млекопитающих. Тирозин – это аминокислота, присутствующая в белках, которые содержат гидроксильную группу, а киназы – это ферменты, которые катализируют фосфорилирование (добавление фосфатной группы) различных субстратов в клетке.
Гидроксильные, аминные и карбоксильные фрагменты в белках могут быть фосфорилированы, что модифицирует белки, чтобы включать или выключать их для различных функций.
Предыдущие отчеты показали, что в генетической аномалии, называемой филадельфийской хромосомой, слияние генов ABL и BCR вызывает лейкемию. Однако точная роль этих генов в нормальном состоянии осталась неизвестной, поскольку генетический нокаут этих генов является летальным.
Группа Йошимуры провела скрининг существующих лекарств, чтобы обнаружить, что эти ферменты фосфорилирования, возникающие из генов ABL и BCR, участвуют в регуляции циркадных часов, тем самым доказав, что химико-генетические подходы полезны для исследования циркадных часов.
«В настоящее время мы расширяем наши химические библиотеки и сейчас проверяем пищевые добавки и натуральные продукты, чтобы найти соединения, которые могут регулировать циркадный ритм у людей», – говорит Йошимура. «Мы надеемся разработать и сможем предоставить новые и безопасные соединения, которые можно принимать перорально для лечения смены часовых поясов."