Теперь команда из Института Броуд Массачусетского технологического института и Гарварда и Медицинской школы Вашингтонского университета преодолела этот барьер с помощью нового типа молекулярного редактора, который может производить точные нуклеотидные изменения C * G-to-T * A в митохондриальной ДНК. Редактор, созданный на основе бактериального токсина, позволяет моделировать связанные с заболеванием мутации митохондриальной ДНК, открывая дверь к лучшему пониманию генетических изменений, связанных с раком, старением и т. Д.
Работа описана в журнале Nature в соавторстве с соавторами Беверли Мок, аспиранткой Института Броуда и Гарвардского университета, и Маркосом де Мораесом, научным сотрудником Вашингтонского университета (UW).
Работой совместно руководили Джозеф Мугус, профессор микробиологии Университета штата Вашингтон и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI), и Дэвид Лю, профессор Ричарда Меркина и директор Института трансформационных технологий Меркина в здравоохранении в Институте Броуда. профессор химии и химической биологии Гарвардского университета и исследователь HHMI.
«Насколько нам известно, команда разработала новый способ манипулирования ДНК и впервые использовала его для точного редактирования митохондриального генома человека, что позволило решить давнюю проблему молекулярной биологии», – сказал Лю. "Эта работа является свидетельством сотрудничества в фундаментальных и прикладных исследованиях и может иметь другие приложения помимо митохондриальной биологии."
Агент бактериальной войны
Большинство современных подходов к изучению конкретных вариаций митохондриальной ДНК включают использование клеток, полученных от пациентов, или небольшого числа животных моделей, в которых мутации произошли случайно. «Но эти методы имеют серьезные ограничения, и создание новых, определенных моделей было невозможно», – сказал соавтор Вамси Мутха, член института и содиректор Программы метаболизма в Broad. Мута также является исследователем HHMI и профессором медицины в Массачусетской больнице общего профиля.
Хотя технологии на основе CRISPR могут быстро и точно редактировать ДНК в ядре клетки, что значительно упрощает создание моделей для многих заболеваний, эти инструменты не могут редактировать митохондриальную ДНК, поскольку они полагаются на направляющую РНК для нацеливания на определенное место в геноме. Митохондриальная мембрана позволяет белкам проникать в органеллы, но, как известно, не имеет доступных путей для транспортировки РНК.
Одна часть потенциального решения возникла, когда лаборатория Mougous идентифицировала токсичный белок, вырабатываемый патогеном Burkholderia cenocepacia. Этот белок может убивать другие бактерии, напрямую превращая цитозин (C) в урацил (U) в двухцепочечной ДНК.
"Что особенного в этом белке и что нам подсказало, что у него могут быть уникальные приложения для редактирования, так это его способность воздействовать на двухцепочечную ДНК.
Все ранее описанные дезаминазы, которые нацелены на ДНК, работают только с одноцепочечной формой, что ограничивает возможности их использования в качестве редакторов генома ", – сказал Мугус. Его команда определила структуру и биохимические характеристики токсина, получившего название DddA.
«Мы поняли, что свойства этого« бактериального боевого агента »могут позволить использовать его в паре с системой нацеливания на ДНК, не основанной на CRISPR, что увеличивает возможность создания редакторов баз, которые не полагаются на CRISPR или на направляющие РНК», объяснил Лю. «Это могло бы позволить нам, наконец, выполнить точное редактирование генома в одном из последних уголков биологии, который остался неприкосновенным для такой технологии – митохондриальной ДНК."
«Укрощение зверя»
Первой серьезной задачей команды было устранить токсичность бактериального агента – то, что Лю описал Мугусу как «приручение зверя», – чтобы он мог редактировать ДНК, не повреждая клетку. Исследователи разделили белок на две неактивные половины, которые могли редактировать ДНК только при объединении.
Исследователи связали две половины прирученного бактериального токсина с ДНК-связывающими белками TALE, которые могут обнаруживать и связывать последовательность ДНК-мишени как в ядре, так и в митохондриях без использования направляющей РНК. Когда эти части связывают ДНК рядом друг с другом, комплекс снова собирается в свою активную форму и преобразует C в U в этом месте, что в конечном итоге приводит к редактированию базы C * G-to-T * A. Исследователи назвали свой инструмент редактором оснований цитозина на основе DddA (DdCBE).
Команда протестировала DdCBE на пяти генах митохондриального генома в клетках человека и обнаружила, что DdCBE внесла точные базовые изменения в до 50 процентов митохондриальной ДНК. Они сосредоточились на гене ND4, который кодирует субъединицу комплекса митохондриальных ферментов I, для дальнейшей характеристики.
Лаборатория Мута проанализировала физиологию и химию митохондрий отредактированных клеток и показала, что изменения затронули митохондрии, как и предполагалось.
«Впервые в моей карьере нам удалось внести точные изменения в митохондриальную ДНК», – сказал Мута. «Это качественный скачок вперед – если мы сможем осуществить целевые мутации, мы сможем разработать модели для изучения вариантов, связанных с заболеванием, определить, какую роль они на самом деле играют в заболевании, и проверить влияние лекарств на задействованные пути."
Будущие разработки
Одной из целей в настоящее время будет разработка редакторов, которые могут точно выполнять другие типы генетических изменений в митохондриальной ДНК.
"Редактор митохондриального генома обладает долгосрочным потенциалом для превращения в терапевтическое средство для лечения заболеваний митохондриального происхождения, и он имеет более непосредственное значение как инструмент, который ученые могут использовать для лучшего моделирования митохондриальных заболеваний и изучения фундаментальных вопросов, относящихся к биологии митохондрий. и генетика ", – сказал Мугус.
Команда добавила, что некоторые особенности DdCBE, такие как отсутствие РНК, также могут быть привлекательными для других приложений редактирования генов за пределами митохондрий.
Эта работа была частично поддержана Институтом трансформирующих технологий в здравоохранении им. Меркина, NIH (R01AI080609, U01AI142756, RM1HG009490, R35GM122455, R35GM118062 и P30DK089507), Агентством по уменьшению угрозы обороны (1-13-1-0014) и Вашингтонским университетом. Фонд кистозного фиброза