Разработанные методы обеспечивают новую экспериментальную платформу для биофизических исследований мембран и, возможно, других компонентов клетки. Это может оказаться полезным для будущих исследований важных взаимодействий, таких как взаимодействие лекарственного средства с мембраной, биотопливо с мембраной и даже взаимодействия антибиотика с мембраной.
Междисциплинарный проект, возглавляемый биофизиком Джоном Катсарасом, химиком Бобом Стандартом и микробиологом Джеймсом Элкинсом, был выполнен в лабораторном реакторе изотопов с высоким потоком и источнике нейтронов расщепления с использованием бактерии Bacillus subtilis. Команда опубликовала свои выводы в журнале PLoS Biology.
Клеточная мембрана представляет собой тонкий бислой липидных молекул, среди которых находятся другие биомолекулы, такие как белки. Исследователи не уверены в том, организуются ли мембранные липиды иногда в группы, называемые доменами, также известными как «рафты», или же они случайным образом распределяются в мембране. Считается, что организация липидов в отдельных доменах внутри клеточной мембраны обеспечивает такие функции, как передача сигналов между клетками.
"Это превратилось в дебаты", – сказал Катсарас. "Некоторые люди считали, что они существуют, а другие – нет.
Было много косвенных доказательств, которые могли поддержать любую из сторон."
Проблема заключалась в том, что существующие методики не могли однозначно решить этот вопрос.
Анализ рассеяния нейтронов был ключом к успеху проекта.
Липидные домены слишком малы, чтобы их можно было увидеть в оптические микроскопы, которые используют свет для исследования образцов, таких как биологические клетки. Однако нейтроны не имеют такого ограничения и могут использоваться для обеспечения наномасштабного изображения клетки. Более того, в отличие от других наноразмерных инструментов, нейтроны можно использовать для исследования живой клетки, не повреждая ее.
Хотя анализ нейтронного рассеяния преодолел ограничения других технологий, он сам по себе поставил ряд серьезных проблем.
Первым была разработка эксперимента, в котором нейтроны рассеивались липидными молекулами в мембране без взаимодействия с другими компонентами клетки, такими как белки, РНК, ДНК и углеводы. Следующей задачей было отличить один тип липидной молекулы от другого.
Решение обеих этих проблем заключается в использовании дейтерия, изотопа водорода, ядро которого содержит нейтрон, а также протон.
Напротив, обычные ядра водорода содержат протон, но не нейтрон. В то время как сама биологическая клетка воспринимает небольшую разницу между нормальным водородом и дейтерием, эти два изотопа кажутся очень разными, если рассматривать их с помощью рассеяния нейтронов.
Команда ORNL создала штамм бактерии, содержащий достаточно дейтерия, чтобы сделать клеточные структуры практически невидимыми для нейтронов. Затем они убедились, что липидные молекулы внутри мембраны полностью состоят из двух жирных кислот, содержащих определенные пропорции дейтерия и водорода.
Впоследствии они ввели два типа жирных кислот с различным соотношением изотопов. Клеточная мембрана была свободна создавать и включать в свою мембрану липидные молекулы из них, причем каждый тип липидов затем содержал определенную смесь двух изотопов.
Если бы липиды были распределены по всей мембране случайным образом, то при воздействии нейтронов мембрана выглядела бы однородной, как если бы оптический фон был средне-серым.
Если, однако, липиды объединятся с другими липидами своего типа, фон перестанет быть однородным и покажет эквивалент более светлых и более темных серых областей. Это на самом деле то, что нашла команда. Серые пятна, обнаруженные с помощью нейтронов размером менее 40 нанометров в поперечнике.
Сама мембрана была около 2.Толщиной 4 нанометра.
Исследователи ORNL подчеркнули, что их подход к созданию внутреннего контраста в живых клетках с использованием изотопов имеет многообещающие перспективы и для других исследований, открывая технику целевого дейтерирования для других физических методов (e.грамм., спектроскопия ядерного магнитного резонанса).
«Люди, которые изучают эти вещи, как правило, используют определенные типы зондов», – отметил Катсарас. "Они не использовали рассеяние нейтронов, потому что его не было в рулевой рубке биолога. Наш новый экспериментальный подход открывает новые области исследований.
«Например, вы можете использовать модифицированные бактерии в качестве платформы для исследования антибиотиков, потому что многие из этих антибиотиков действительно взаимодействуют с мембраной."