Теперь новый инструмент, созданный исследователями из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете и Гарвардской медицинской школы (HMS), предлагает решение этой проблемы в виде набора бактериальных генов, которые были разработаны для обнаружения и регистрации изменений. в росте различных популяций бактерий с течением времени в кишечнике живых мышей с точностью до одной клетки, и может служить платформой для сложной, основанной на синтетической биологии диагностики и терапии для различных применений в кишечнике. Исследование опубликовано в Nature Communications.
Удерживая время
Система использует колеблющуюся генную цепь, называемую репрессилятором, как своего рода генетические часы для измерения роста бактерий.
Репрессилятор состоит из трех бактериальных генов, кодирующих три белка (tetR, cl и lacI), каждый из которых блокирует экспрессию одного из других белков. Гены связаны в петлю отрицательной обратной связи, так что, когда концентрация одного из репрессорных белков падает ниже определенного уровня, белок, который он репрессировал, экспрессируется, что блокирует экспрессию третьего белка, и процесс повторяется в циклическая мода.
Когда все три гена вставлены в плазмиду и введены в бактерии, количество завершенных циклов отрицательной обратной связи может служить записью того, сколько клеточных делений претерпели бактерии.
Каждый раз, когда бактерии делятся, любые репрессорные белки, присутствующие в их цитоплазме, разбавляются, поэтому их концентрация постепенно падает и запускает экспрессию следующего белка в цикле репрессилятора. Важно отметить, что цикл репрессилятора повторяется через 15 минут.5 поколений бактерий независимо от того, как быстро или медленно растут бактерии. Это позволяет ему действовать как объективное измерение времени, как часы или часы.
«Представьте, что у вас есть два человека, носящих два разных часа, а секундная стрелка на часах одного человека движется в два раза быстрее, чем у другого», – объяснил первый автор Дэвид Риглар, доктор философии.D., бывший постдок Института Висса и HMS, который в настоящее время возглавляет исследовательскую группу в качестве научного сотрудника сэра Генри Дейла в Имперском колледже Лондона. "Если вы остановите обе часы через час, они не согласятся, какое время это было, потому что их измерение времени зависит от скорости движения секундной стрелки.
Напротив, наш репрессилятор похож на часы, которые всегда движутся с одинаковой скоростью, поэтому независимо от того, сколько разных людей носят их, все они будут давать единообразное измерение времени. Это качество позволяет более точно изучать поведение бактерий в кишечнике."
Исследователи соединили каждый из трех репрессорных белков с флуоресцентной молекулой разного цвета и разработали рабочий процесс визуализации под названием RINGS (вывод о росте на уровне одной клетки на основе репрессилятора), чтобы отслеживать, какой белок экспрессируется в разные моменты времени во время роста бактерий. «По мере того как бактериальная колония растет наружу, схема репрессилятора создает эти различные флуоресцентные, похожие на древовидные кольца сигнатуры на основе того, какой белок-репрессор был активен в единственной бактерии, которая начала колонию», – сказал Риглар. "Схема флуоресцентных колец показывает, сколько циклов репрессилятора произошло с момента начала роста, и мы можем проанализировать эту схему, чтобы изучить, как скорость роста различается между разными бактериями и в разных средах."
Используя RINGS, команда смогла успешно отследить деления клеток у нескольких различных видов бактерий, выращенных in vitro, и заметила, что продолжительность цикла репрессилятора бактерий оставалась постоянной, когда они выращивались на извлеченных образцах кишечника мыши (для моделирования сложной микросреды). или подвергались воздействию антибиотиков (для имитации стрессовых условий и нестабильных моделей роста).
Отслеживание изменений
Чтобы оценить эффективность репрессилятора in vivo, команда ввела E. coli, содержащую контур репрессилятора, для мышей перорально, затем проанализировали бактерии, извлеченные из образцов фекалий.
Репрессилятор оставался активным в течение 16 дней после введения, показывая, что долговременная осцилляторная экспрессия генов может поддерживаться в кишечных бактериях у живых млекопитающих. Анализ RINGS успешно обнаружил изменения в паттернах роста бактерий, и бактерии, чьи схемы репрессиляторов находились на разных стадиях, можно было «синхронизировать», дав мышам соединение в их питьевой воде, которое остановило цикл репрессиляторов на данной стадии.
Наконец, исследователи проверили способность репрессилятора обнаруживать различия в скорости роста бактерий, которые наблюдались в результате воспаления кишечника. Мышам давали соединение, вызывающее воспаление, а затем – бактерии, нагруженные репрессиляторами.
Через 15 часов анализ RINGS показал, что бактерии от мышей с воспалением обладали репрессиляторами в более широком диапазоне фаз по сравнению с бактериями от контрольных мышей, что позволяет предположить, что воспаление создает среду, которая вызывает несоответствие в росте бактерий, что потенциально приводит к дисбалансу в микробиоме кишечника.
«Этот репрессилятор позволяет нам действительно исследовать тонкости поведения бактерий в живом кишечнике не только как в здоровом, так и в болезненном состоянии, но также пространственно и временно», – сказала автор-корреспондент Памела Сильвер, доктор философии.D., который является основным преподавателем в Институте Висса и Elliot T. и Onie H. Адамс, профессор биохимии и системной биологии в HMS. «Тот факт, что мы можем повторно синхронизировать репрессилятор, когда он уже находится в кишечнике, а также поддерживать его без необходимости введения селективных антибиотиков, также означает, что мы можем изучать микробиом в более естественном состоянии с минимальными нарушениями."
В дополнение к пониманию динамики микробиома, репрессилятор раскрывает потенциал для комплексной, основанной на синтетической биологии диагностики и лечения кишечника человека.
Возможные применения включают создание системы, которая запрограммирована на запуск каскада транскрипции генов в определенный момент циркадного ритма, или диагностику, которая регистрирует, сколько времени прошло после обнаружения данного биомаркера.
«Это исследование не только решает конкретную проблему, связанную с мониторингом динамических изменений физиологии микробиома в живом кишечнике, но и предоставляет платформу, которая может привести к совершенно новым типам диагностики и даже зависимым от времени терапевтическим средствам."сказал директор-основатель Wyss Дональд Ингбер, M.D., Ph.D., который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в HMS и программе сосудистой биологии в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии в Гарвардском университете Джона А. Школа инженерии и прикладных наук Полсона.
Дополнительными авторами статьи являются Дэвид Ричмонд, Лоран Потвин-Тротье, Эндрю Вердегаал, Соменат Бакши, Эмануэле Леонсини, Лорена Лайон и Йохан Полссон из HMS, а также Александр Найдич из Института Висс, HMS, и Джон А. Школа инженерии и прикладных наук Полсона.
Это исследование было поддержано долгосрочной стипендией Human Frontier Science Programme, Фондом Мензиса, Wellcome Trust, Национальным научным фондом, Агентством перспективных исследовательских проектов Министерства обороны, Гарвардской медицинской школой и Институтом биологической инженерии Висса.