Команда исследователей из Массачусетского технологического института теперь применила новый подход к получению изображений с таким высоким разрешением: вместо того, чтобы делать свои микроскопы более мощными, они открыли метод, который увеличивает образцы тканей, встраивая их в полимер, который набухает при добавлении воды. Это позволяет физически увеличивать образцы, а затем получать изображения с гораздо более высоким разрешением.
По словам исследователей, этот метод, в котором используются недорогие, коммерчески доступные химические вещества и микроскопы, обычно используемые в исследовательских лабораториях, должен предоставить гораздо большему числу ученых доступ к изображениям сверхвысокого разрешения.
"Вместо того, чтобы покупать новый микроскоп для получения изображений с наноразмерным разрешением, вы можете делать изображения на обычном микроскопе.
Вы физически увеличиваете образец, а не пытаетесь увеличить лучи света, испускаемые образцом », – говорит Эд Бойден, доцент кафедры биологической инженерии, мозга и когнитивных наук Массачусетского технологического института.
Бойден – старший автор статьи, описывающей новый метод в январе. 15 онлайн-издание журнала Science.
Ведущие авторы статьи – аспиранты Фэй Чен и Пол Тилберг.
Физическое увеличение
Большинство микроскопов работают с использованием линз для фокусировки света, излучаемого образцом, на увеличенное изображение.
Однако этот подход имеет фундаментальный предел, известный как предел дифракции, что означает, что его нельзя использовать для визуализации объектов, намного меньших, чем длина волны используемого света. Например, если вы используете сине-зеленый свет с длиной волны 500 нанометров, вы не увидите ничего меньше 250 нанометров.
«К сожалению, в биологии все становится интересно», – говорит Бойден, член Media Lab Массачусетского технологического института и Института исследований мозга Макговерна. Белковые комплексы, молекулы, которые транспортируют полезные нагрузки в клетки и из них, а также другие виды клеточной активности организованы в наномасштабе.
По словам Бойдена, ученые придумали несколько «действительно хитрых уловок», чтобы преодолеть это ограничение. Однако эти методы сверхвысокого разрешения лучше всего работают с небольшими тонкими образцами и требуют много времени для получения изображений больших образцов. «Если вы хотите составить карту мозга или понять, как раковые клетки организованы в метастазирующей опухоли, или как иммунные клетки настроены при аутоиммунной атаке, вам нужно посмотреть на большой кусок ткани с точностью до нанометра», – говорит он.
Для этого команда Массачусетского технологического института сосредоточила свое внимание на образце, а не на микроскопе. Их идея заключалась в том, чтобы упростить получение изображений образцов с высоким разрешением, заключив их в расширяющийся полимерный гель из полиакрилата, очень абсорбирующего материала, обычно встречающегося в подгузниках.
Перед увеличением ткани исследователи сначала маркируют клеточные компоненты или белки, которые они хотят исследовать, используя антитело, которое связывается с выбранными мишенями. Это антитело связано с флуоресцентным красителем, а также с химическим якорем, который может прикреплять краситель к полиакрилатной цепи.
После того, как ткань промаркирована, исследователи добавляют прекурсор к полиакрилатному гелю и нагревают его до образования геля.
Затем они переваривают белки, которые скрепляют образец, позволяя ему равномерно расширяться. Затем образец промывают в бессолевой воде для увеличения объема в 100 раз. Несмотря на то, что белки были разделены, исходное расположение каждой флуоресцентной метки остается неизменным относительно общей структуры ткани, поскольку она прикреплена к полиакрилатному гелю.
"У вас остается трехмерный флуоресцентный слепок исходного материала.
А сама гипсовая повязка опухшая, что не мешает исходной биологической структуре », – говорит Тилберг.
Команда Массачусетского технологического института визуализировала этот «слепок» с помощью коммерчески доступных конфокальных микроскопов, обычно используемых для флуоресцентной визуализации, но обычно ограниченных разрешением в сотни нанометров. С их увеличенными образцами исследователи достигли разрешения до 70 нанометров. "Процесс экспансионной микроскопии … должны быть совместимы со многими существующими конструкциями микроскопов и системами, уже находящимися в лабораториях ", – добавляет Чен.
Большие образцы тканей
Используя эту технику, команда Массачусетского технологического института смогла получить изображение среза ткани мозга размером 500 на 200 на 100 микрон с помощью стандартного конфокального микроскопа. Создание изображений таких больших образцов было бы невозможным с помощью других методов сверхвысокого разрешения, которые требуют минут для изображения среза ткани толщиной всего 1 микрон и ограничены в их способности отображать большие образцы из-за оптического рассеяния и других аберраций.
«Другие методы в настоящее время имеют лучшее разрешение, но их труднее использовать или они медленнее», – говорит Тилберг. «Преимущества нашего метода – простота использования и, что более важно, совместимость с большими объемами, что затрудняет существующие технологии."
Исследователи предполагают, что эта технология может быть очень полезной для ученых, пытающихся визуализировать клетки мозга и отобразить, как они соединяются друг с другом в больших регионах.
«Есть много биологических вопросов, когда вам нужно понять большую структуру», – говорит Бойден. «Специально для мозга вы должны иметь возможность отображать большой объем ткани, а также видеть, где находятся все наноразмерные компоненты."
В то время как команда Бойдена сосредоточена на мозге, другие возможные применения этого метода включают изучение метастазов опухоли и ангиогенеза (рост кровеносных сосудов для питания опухоли) или визуализацию того, как иммунные клетки атакуют определенные органы во время аутоиммунного заболевания.