Исследование, проведенное итальянскими учеными, показало, что есть способ обойти эти осложнения. Команда обнаружила, что использование более точной технологии редактирования генов, которая вызывает меньше разрывов в ДНК, может держать под контролем естественные пути реакции стволовых клеток на повреждение.
Результаты опубликованы 21 марта в журнале Cell Stem Cell.
«Редактирование генома – очень мощная стратегия точной генной инженерии стволовых клеток, но требует сложной процедуры», – говорит соавтор исследования Пьетро Дженовезе, ученый из Института генной терапии Сан-Раффаэле в Милане. "Несмотря на огромный терапевтический потенциал и постоянный прогресс в совершенствовании платформ для редактирования генов, функциональные последствия процесса редактирования еще предстоит полностью выяснить."
Одним из препятствий на пути к успешному редактированию генома оказывается р53, белок, который часто называют «хранителем генома» из-за его роли в сохранении стабильности ДНК и предотвращении мутаций.
Когда CRISPR редактирует гены, он разрезает обе нити ДНК в определенных местах. Но эти двухцепочечные разрывы могут сигнализировать р53, что что-то не так.
Затем белок начинает действовать и предотвращает размножение клеток. Это противоположно тому, что желательно, когда клетки используются в качестве потенциальной терапии. Тем не менее, постоянное отключение p53 для предотвращения этого защитного механизма может привести к образованию опухолей; дефектный p53 вовлечен примерно в половину всех видов рака.
Команда в Милане нашла способ обойти это нежелательное последствие. При редактировании генов нуклеазы используются как «генетические ножницы» для индукции разрывов ДНК, за которыми следует аденоассоциированный вирусный вектор, доставляющий корректирующую последовательность. Но когда эти ножницы недостаточно специфичны, они могут разрезать ДНК во многих дополнительных местах.
Исследователи использовали комбинацию высокоспецифичных нуклеаз и векторов для введения только желаемого разрыва в ДНК гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников (HSPC).
«Мы показали, что влияние редактирования генов на HSPCs во многом зависит от точности используемой дизайнерской нуклеазы», - говорит Луиджи Налдини, соавтор другого исследования и директор Института генной терапии в Сан-Раффаэле. «Если нуклеазы не являются высокоспецифичными и, таким образом, разрезают ДНК не только на намеченной мишени, но и на нескольких дополнительных нецелевых сайтах, мы действительно видим устойчивый и продолжительный ответ p53, ведущий к пагубным последствиям вплоть до необратимого ареста клетки.
«С другой стороны, – добавляет он, – если нуклеаза высокоспецифична – и мы используем высокоочищенные реагенты и оптимизированные протоколы – мы видим только временный эффект на пролиферацию клеток». Это, по-видимому, полностью обратимо и совместимо с поддержанием важных биологических свойств гемопоэтических стволовых клеток."
«Предыдущие исследования указали на теоретический риск отбора мутаций, инактивирующих p53, при редактировании, тем самым подчеркнув возможный канцерогенный риск, связанный с процедурами редактирования генов таким образом, который может поставить под угрозу его терапевтический потенциал», – говорит Рафаэлла Ди Микко, третий сотрудник исследования. – старший автор, возглавляющий лабораторию в Институте генной терапии в Сан-Раффаэле. «Наша работа показывает, что HSPC хорошо переносят один или несколько разрывов ДНК, с лишь временной активацией p53 и ограниченным влиянием на их функциональность (в основном проявляясь замедленной пролиферацией).
Этот клеточный ответ немного более продолжительный, когда высокоспецифичные «генетические ножницы» используются в сочетании с аденоассоциированными вирусными векторами, доставляющими корректирующую последовательность ДНК. Однако, если мы временно инактивируем ответ p53 во время редактирования гена, мы можем противодействовать этому эффекту и повысить выход отредактированных клеток без признаков увеличения мутаций или нестабильности генома."
«Другой серьезной проблемой редактирования генов в HSPC является относительно низкая эффективность гомологичной рекомбинации в HSPC, которая требуется для введения корректирующей последовательности, доставляемой матрицей репарации», – заключает Налдини. "Это препятствие теперь существенно облегчено новыми методами, описанными в нашей и других недавних статьях."
Исследователи говорят, что эта работа предоставляет молекулярные доказательства возможности и эффективности генной инженерии в HSPC.
Это вселяет в них уверенность в том, что технология будет успешно применена для испытаний на людях.
Эта работа была поддержана грантами Telethon, Министерства здравоохранения Италии и Долгосрочной междисциплинарной стипендией Human Frontier Science Program (HFSP).
Он также был поддержан программой ATIP-Avenir (Inserm / CNRS, Франция), Французской ассоциацией исследований рака (фонд ARC, Франция), пилотным и посевным грантом от больницы Сан-Раффаэле и стипендией FIRC-AIRC для Италии.
Луиджи Налдини получил финансирование от Editas Medicine для совместного проекта редактирования генов, отличного от работы, описанной здесь.
Он также является членом научного консультативного совета Sangamo Therapeutics. Луиджи Налдини и Пьетро Дженовезе являются изобретателями патентов, касающихся применения редактирования генов в генной терапии HSPC, принадлежащих и управляемых Научным институтом Сан-Раффаэле и Фондом Telethon, включая патентную заявку на использование ингибитора p53 в редактировании генов, недавно поданную несколькими из авторы этого исследования.