«Наш новый микроскоп можно использовать для изучения влияния различных генетических мутаций на функцию нейронов», – сказал Адам Коэн из Гарвардского университета, США, и руководитель исследовательской группы, которая разработала микроскоп. "Когда-нибудь его можно будет использовать для проверки воздействия лекарств-кандидатов на нейроны, полученные от людей с расстройствами нервной системы, чтобы попытаться определить лекарства для лечения заболеваний, которые не имеют адекватного лечения прямо сейчас."
Новый микроскоп под названием Firefly может отображать область диаметром 6 миллиметров, что более чем в сто раз превышает поле зрения большинства микроскопов, используемых в оптогенетике.
Вместо того, чтобы изучать электрическую активность одного нейрона, большая область изображения позволяет запускать электрические импульсы, которые нейроны используют для связи, а затем наблюдать, как эти импульсы перемещаются от клетки к клетке по большой нейронной цепи, содержащей сотни клеток. В головном мозге каждый нейрон обычно соединяется с тысячей других нейронов, поэтому просмотр более крупной сети важен для понимания того, как неврологические заболевания влияют на нейронную связь.
В журнале Biomedical Optics Express Оптического общества (OSA) Коэн и его коллеги сообщают, как они собрали новый микроскоп менее чем за 100000 долларов с использованием компонентов, которые почти все коммерчески доступны. Микроскоп не только отображает большую площадь, но и очень эффективно собирает свет.
Это обеспечивает высокое качество изображения и высокую скорость, необходимые для наблюдения за электрическими импульсами нейронов, каждый из которых длится всего одну тысячную секунды.
Использование света, чтобы увидеть огонь нейронов
Новый микроскоп идеально подходит для изучения нейронов человека, выращенных в лаборатории.
За последнее десятилетие ученые разработали модели клеток человека для многих расстройств нервной системы. Эти клетки можно генетически модифицировать, чтобы они содержали светочувствительные белки, которые позволяют ученым использовать свет для возбуждения нейронов или для управления такими переменными, как уровни нейротрансмиттеров или агрегация белков. Другие светочувствительные флуоресцентные белки превращают невидимые электрические импульсы, исходящие от нейронов, в короткие вспышки флуоресценции, которые можно визуализировать и измерить.
Эти методы позволили ученым изучить вход и выход отдельных нейронов, но коммерчески доступные микроскопы не оптимизированы для полного использования потенциала оптогенетических подходов.
Чтобы восполнить этот технологический пробел, исследователи разработали микроскоп Firefly, который стимулирует нейроны сложным узором, содержащим миллион световых точек, а затем записывает короткие вспышки световой флуоресценции, соответствующие электрическим импульсам, испускаемым нейронами.
Каждый пиксель светового рисунка может независимо стимулировать светочувствительный белок. Поскольку пиксели могут быть разных цветов, можно сразу запускать разные типы светочувствительных белков.
Световой узор может быть запрограммирован таким образом, чтобы охватить весь нейрон, стимулировать определенные области нейрона или использоваться для одновременного освещения нескольких клеток.
«Эта оптическая система обеспечивает миллион входов и миллион выходов, позволяя нам видеть все, что происходит в этих нейронных культурах», – объяснил Коэн.
После стимуляции нейронов микроскоп использует изображение камеры с частотой тысячи кадров в секунду для фиксации флуоресценции, вызванной чрезвычайно короткими электрическими импульсами. «Оптическая система должна быть высокоэффективной, чтобы обнаруживать хорошие сигналы в течение миллисекунды», – сказал Коэн. «На разработку оптики, которая может не только отображать большие площади, но и с очень высокой эффективностью сбора света, потребовалось много инженерных усилий."
Чтобы эффективно собирать свет на большой площади, микроскоп Firefly использует линзу объектива размером с газированную банку, а не линзу объектива размером с большой палец, используемую в большинстве микроскопов.
Исследователи также использовали оптическую установку, которая увеличивает количество света, стимулирующего нейроны, чтобы гарантировать, что нейроны излучают яркую флуоресценцию при возбуждении.
«Единственный нестандартный элемент в микроскопе – это небольшая призма, помещенная между нейронами и линзой объектива», – пояснил Коэн. "Этот важный компонент заставляет свет перемещаться по той же плоскости, что и клетки, а не попадать в образец перпендикулярно.
Это не позволяет свету освещать материал над и под клетками, уменьшая фоновую флуоресценцию, из-за которой трудно увидеть флуоресценцию, исходящую от нейронов."
Наблюдение за 85 нейронами одновременно
Исследователи продемонстрировали свой новый микроскоп, используя его для оптической стимуляции и регистрации флуоресценции культивируемых нейронов человека. «Нейроны представляли собой большой спутанный беспорядок из спагетти», – сказал Коэн. «Мы показали, что можно одновременно разрешить 85 отдельных нейронов за время измерения, которое заняло около 30 секунд."
После первоначальной стимуляции и визуализации исследователи смогли найти 79 из этих 85 клеток во второй раз.
Эта возможность важна для исследований, которые требуют визуализации каждой клетки до и после воздействия лекарственного средства, например.
Во второй демонстрации исследователи использовали микроскоп, чтобы отобразить электрические волны, распространяющиеся через культивируемые клетки сердца. Это показало, что микроскоп можно использовать для изучения аномальных сердечных ритмов, которые возникают, когда электрические сигналы, координирующие сердцебиение, не работают должным образом.
«Система, которую мы разработали, предназначена для изучения относительно плоского образца, такого как культивируемые клетки», – сказал Коэн. «Сейчас мы разрабатываем систему для выполнения оптогенетических подходов к интактной ткани, которая позволит нам посмотреть, как эти нейроны ведут себя в своем естественном контексте."
Исследователи также основали биотехнологическую компанию под названием Q-State Biosciences, которая использует улучшенную версию микроскопа для работы с фармацевтическими компаниями над открытием новых лекарств.