Усовершенствованный метод особенно полезен при попытке исправить генетические мутации, вызывающие наследственные заболевания, такие как серповидно-клеточная анемия или тяжелый комбинированный иммунодефицит. Этот метод позволяет исследователям исправлять аномальный участок ДНК с помощью нормальной последовательности и потенциально исправлять дефект, и уже работает в культуре клеток, чтобы улучшить текущие усилия по восстановлению дефектных генов.
«Самое захватывающее в CRISPR-Cas9 – это обещание исправить гены на месте в нашем геноме, но эффективность этого может быть очень низкой», – сказал Джейкоб Корн, научный директор Innovative Genomics Initiative в Калифорнийском университете в Беркли. по редактированию генома следующего поколения и регуляции генов для лабораторных и клинических приложений. "Если вы думаете о редактировании генов как о текстовом процессоре, мы знаем, как вырезать, но нам нужен более эффективный способ вставить и приклеить новый фрагмент ДНК туда, где мы делаем вырез."
«В случаях, когда вы хотите изменить очень маленькие участки ДНК, до 30 пар оснований, этот метод будет чрезвычайно эффективным», – сказал первый автор Кристофер Ричардсон, постдок IGI.
Проблемы с короткими участками ДНК, включая мутации одной пары оснований, типичны для многих генетических заболеваний. Пары оснований – это отдельные строительные блоки ДНК, нанизанные встык в цепи, которая наматывается вокруг комплементарной цепи, образуя хорошо известную спиральную двухцепочечную молекулу ДНК.
Ричардсон, Корн и их коллеги из IGI описывают новую технику Ян. 21 номер журнала Nature Biotechnology.
Зацепившись за свободную прядь
Ричардсон изобрел новый подход после того, как обнаружил, что белок Cas9, который фактически разрезал ДНК, остается прикрепленным к хромосоме в течение шести часов, спустя много времени после того, как он прорезал двухцепочечную ДНК.
Ричардсон внимательно изучил белок Cas9, связанный с двумя цепями ДНК, и обнаружил, что, хотя белок висит на трех отрезанных концах, один из концов остается свободным.
Когда Cas9 разрезает ДНК, системы репарации в клетке могут захватить фрагмент комплементарной ДНК, называемый матрицей, для восстановления разреза.
Исследователи могут добавлять шаблоны, содержащие изменения, которые изменяют существующие последовательности в геноме – например, исправляют мутацию, вызывающую заболевание.
Ричардсон рассудил, что перенос замещающей матрицы непосредственно на место разреза повысит эффективность исправления, и сконструировал фрагмент ДНК, который соответствует свободному концу ДНК и несет генетическую последовательность, которая должна быть вставлена на другом конце.
Техника работала очень хорошо, позволяя успешно исправить мутацию с эффективностью до 60 процентов.
«Наши данные показывают, что разрывы Cas9 могут отличаться на молекулярном уровне от разрывов, генерируемых другими целевыми нуклеазами, такими как TALENS и нуклеазы цинковых пальцев, что предполагает, что стратегии, подобные тем, которые мы используем, могут дать вам более эффективное восстановление разрывов Cas9. , "Сказал Ричардсон.
Исследователи также показали, что варианты белка Cas9, которые связывают ДНК, но не разрезают, также могут успешно вставлять новую последовательность ДНК в сайт связывания, возможно, за счет образования «пузырьковой» структуры на целевой ДНК, которая также действует, чтобы привлечь репарационную матрицу.
Редактирование генов с использованием Cas9 без разрезания генома может быть более безопасным, чем обычное редактирование генов, поскольку устраняет опасность нецелевого разрезания в геноме, сказал Корн.